蛋白Marker即蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，是一些已知分子量的蛋白質(zhì)的混合物,，像“尺子”一樣用來(lái)指示蛋白質(zhì)條帶的大小,。

在Western Blot過(guò)程中，分子量Marker就像個(gè)螺絲釘一樣雖然是其中小小的一環(huán),，然而就是這樣一個(gè)小細(xì)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著不可忽視的作用,。Marker的作用主要是用來(lái)指示蛋白條帶所對(duì)應(yīng)的分子量大小，只有標(biāo)準(zhǔn)量精確無(wú)誤了,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有說(shuō)服力,，除此之外，蛋白Marker還有顯示轉(zhuǎn)膜是否成功,、以及蛋白在凝膠上的電泳程度等作用,，因此選擇正確的蛋白Marker也是Western Blot實(shí)驗(yàn)成功的必要條件之一,。我們整理了一些在實(shí)驗(yàn)中蛋白Marker的常見(jiàn)問(wèn)題，快來(lái)學(xué)習(xí)吧,！

一,、marker一定要都跑出來(lái)嗎？

比如說(shuō)說(shuō)明書(shū)上市7條帶,，其實(shí)跑出6條帶是正常的,可能是跑的時(shí)間不夠,如果你的蛋白不是很小的話,可以等溴酚藍(lán)前沿剛跑出膠的時(shí)候再關(guān)電泳儀,這樣應(yīng)該可以有7條帶.有的時(shí)候還會(huì)跑出5條,不過(guò)只要在你的目的蛋白的上下兩個(gè)帶都跑出來(lái)了就可以了,不一定非要7條,。

二、marker變成笑臉狀怎么辦,？

第一,，膠沒(méi)有壓片

第二，膠在板的邊緣與中心的膠的流動(dòng)性可能不同,，這個(gè)沒(méi)有辦法,，跟黏度和表面張力有關(guān)。如果各種方法都不能解決上面的現(xiàn)象,，個(gè)人建議maker換一條道上樣,，選一條靠近中間的泳道跑一跑。

邊緣效應(yīng),，在邊緣兩個(gè)泳道的樣品會(huì)這樣的,。可以試試電泳速度慢點(diǎn)兒......

要么配膠時(shí)沒(méi)壓好,，膠沒(méi)配好,，要么電泳時(shí)電壓太大，電滲力強(qiáng),，要么玻板電泳時(shí)沒(méi)夾好,，內(nèi)電泳液是漏的，請(qǐng)逐一排查,。

三,、marker條帶變寬怎么解決？

原因一：上樣量過(guò)多,，應(yīng)該減少上樣量,。

對(duì)策：加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15μL（即2-10μg蛋白質(zhì)）,。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到100μL,。
原因二：樣品溶解不wan全。
對(duì)策：

(1)樣品應(yīng)該充分溶解：保持各種蛋白質(zhì)樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解,，上樣前最好離心一下,，實(shí)在溶解不掉的顆粒就去掉。
(2)可以根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)試劑盒的要求加入樣品溶解液,；如果是自行配置標(biāo)準(zhǔn)和未知樣品,，按照0.5-1.0mg/L樣品溶解液,。溶解后，將其轉(zhuǎn)移至Ep管,，蓋上蓋子（可以在蓋子處加上卡子）后在110度沸水中水浴加熱3分鐘（可以在薄泡沫塑料板上鉆出幾個(gè)與Ep管直徑形同的圓洞,，Ep管放下去直到蓋子邊緣約束不能再往下為止，把薄泡沫塑料板的暴露出Ep管的管體大部分的那一面放入沸水浴鍋中,，薄泡沫塑料板自然飄在沸水表面,，便于取用和加熱，也可避免沸水濺起,。

可以一批對(duì)于多個(gè)Ep管進(jìn)行不同時(shí)間的沸水浴,。不要把Ep管扔進(jìn)沸水浴鍋中，蓋子可能會(huì)被沖開(kāi)）,，而后在室溫下冷卻待用,。如果較長(zhǎng)時(shí)間不用，則將樣品放入零下20度冰箱中儲(chǔ)存,，需用時(shí)在取出后使用前在110度沸水中加熱3分鐘室溫冷卻后再上樣,，以去掉樣品蛋白質(zhì)中的亞穩(wěn)態(tài)聚合體。
(3)改變樣品緩沖溶液使得樣品能夠充分溶解,，SDS 用量要充分,。
原因：SDS電泳帶與鄰近蛋白質(zhì)電泳相連。除了上樣量過(guò)多和樣品溶解不wan全外,，凝膠的加樣孔泄露會(huì)使得電泳帶變寬,。加樣孔泄露往往由于凝膠與玻璃板之間產(chǎn)生裂紋引起。對(duì)策：此時(shí)只能重新制備凝膠,，梳子拔起時(shí)要小心等凝膠凝聚完畢,，速度不宜過(guò)快,，拔起的方向要垂直于凝膠表面,；要避免凝膠兩側(cè)的玻璃板與凝膠之間產(chǎn)生裂紋，在凝膠制備過(guò)程中不要擠壓凝膠兩側(cè)的玻璃板,。

本期內(nèi)容：蛋白Marker的常見(jiàn)問(wèn)題解答

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