透射電鏡常用的50-100 kV電子束來說,，樣品的厚度控制在10～100 nm為宜。由于電鏡產(chǎn)生的電子束穿透能力很弱,，需要把標本切成厚度小于0.1 µm以下的薄片才適用,，這種薄片稱為超薄切片(Ultrathin sectioning)。常用的超薄切片厚度是50-70 nm,，也可進行冷凍超薄切片,。

超薄切片技術(shù)是為透射電子顯微鏡觀察提供薄樣品的專門技術(shù)，研究材料類,、生物類樣品的基本技術(shù),，尤其是觀察細胞、組織,、器官等的超微結(jié)構(gòu)以及亞細胞結(jié)構(gòu)常用的技術(shù),。也是電鏡細胞化學、免疫電鏡等技術(shù)的關(guān)鍵性技術(shù),。它在生物學的發(fā)展過程中占據(jù)重要的地位,，目前各種細胞、組織的超微結(jié)構(gòu)知識幾乎都是由它提供的,。

冷凍超薄切片機 Leica EM UC7

取材→固定→脫水→包埋（滲透,、包埋、聚合）→超薄切片→電子染色（生物類）

取材→清洗→包埋（滲透,、包埋,、聚合）→超薄切片→電子染色（材料類）

生物樣品超薄切片要求：

（2）切片厚度50-100 nm為宜：太薄反差低,；太厚反差好,，但結(jié)構(gòu)重疊，電子束不能穿透,；

（3）切片應耐電子束的強烈照射,，不變形不升華；

（4）切片能夠適當被染色,，保證一定的反差,；

（5）切片均勻，無皺褶,、刀痕，無染色劑或其他化學物質(zhì)的沉淀。

目地和要求

（1）新鮮,。(材料離體后1-5 min內(nèi)進入固定液,，避免細胞自溶和結(jié)構(gòu)變化)

（2）體積小,。(厚度<1 mm，長度寬度均<5 mm,，固定液滲透能力有限，組織太大會導致無法固定充分）

（3）機械損傷小,。(動作輕巧,，器械鋒利，避免對組織的擠壓和推拉,，建議用剃須刀片,、手術(shù)刀片、手術(shù)剪刀,。)

（4）低溫操作,，器械、容器,、固定液均需預冷（降低酶的活性,，減少組織自溶）。

（5）取材部位準確,，且注意材料的方向性和定位,。

目的和要求：終止組織細胞的生化過程同時把它們的超微結(jié)構(gòu)改變控制在最小范圍內(nèi)，并保護這些結(jié)構(gòu)在后續(xù)的脫水,、包埋等過程中不被破壞,；將蛋白、離子等內(nèi)容物保留在原位,，以便后續(xù)的研究,。

（1）破壞細胞的酶活性系統(tǒng)

（2）穩(wěn)定細胞物質(zhì)成分，并保存之

（3）接近細胞生活狀態(tài)的滲透壓,使細胞不收縮或膨脹

（4）在組分的分子之間建立交聯(lián),，提供骨架穩(wěn)定細胞器的空間構(gòu)型

（5）提供一定的電子反差

戊二醛（C5H8O2)：滲透性好,，保存蛋白質(zhì)、酶活性,，穩(wěn)定糖元,，無電子染色作用，固定脂類和膜差,?？砷L時固定（低溫可達半年）。

鋨酸（OsO4)：強氧化劑,，固定脂類,、膜結(jié)構(gòu),，有電子染色作用；破壞酶活性,。

多聚甲醛：優(yōu)良地保存酶活性,，用于細胞化學。

緩沖液：仿效細胞外液成分,，對細胞富有生理保護,。維持穩(wěn)定的pH值；提供適當?shù)臐B透壓,；提供適當?shù)碾x子成分使樣品不抽提,，不沉淀。

    1.pH值：動物組織7.2-7.4,，植物6.8-7.0,，高度含水組織8.0-8.4

    2.緩沖液類型：磷酸緩沖液、緩沖液等,，0.05-0.1 mol/L

    3.滲透壓：KCl, NaCl, 蔗糖調(diào)節(jié)

    4.固定劑濃度：戊二醛2-6%等

    5.材料大?。?.5-1 mm3

操作步驟：

戊二醛固定液：有細胞壁的樣品5%，無細胞壁樣品3%,。加入緩沖體系,，確保生物樣本內(nèi)外滲透壓，避免細胞縮小或吸漲,。

30％→50％→70％→80％→90％→95％(以上步驟每次15-20 min)→100％(2-3次,，每次15 min)→100％丙酮(20 min) 

常用Epon 812,、Spurr,、LR white等

可手工,、機械修塊,。

醋酸鈾：主要染核酸,、核蛋白、細胞核,、結(jié)締組織,。要避光，有微弱的放射性

檸檬酸鉛：主要染膜結(jié)構(gòu),、脂類,、核酸。易與CO2反應成沉淀,，染色中應避免,。

步驟：單染：鉛鹽單染,鈾鹽單染。