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2023年單個(gè)外泌體表征分析技術(shù)JEV文章盤(pán)點(diǎn)
外泌體是包含了復(fù)雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡,，是細(xì)胞間信號(hào)傳輸?shù)妮d體,。多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，它們廣泛存在于血液,、唾液,、尿液、腦脊液和乳汁等體液中,，參與細(xì)胞間通訊,。近年來(lái)，外泌體的研究熱度持續(xù)攀升,，已成為當(dāng)前生命科學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的一大熱點(diǎn),，在2023 年國(guó)家自然科學(xué)基金獲批項(xiàng)目中，外泌體研究相關(guān)項(xiàng)目的總數(shù)近390個(gè),，立項(xiàng)的總金額突破1.5 億元,。但受限于外泌體的尺寸（30~200 nm），常規(guī)的光學(xué)顯微鏡無(wú)法對(duì)其進(jìn)行成像分析,，因此很少有技術(shù)能夠?qū)蝹€(gè)外泌體進(jìn)行物理表征和蛋白分型,。
美國(guó) NanoView Biosciences 公司推出的全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng) ExoView R200系統(tǒng)，采用了特殊的 SP-IRIS 成像技術(shù),，只需要少量樣品即可一次完成外泌體計(jì)數(shù),、粒徑、蛋白表達(dá),、蛋白共定位,、亞群分布的分析。全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng) ExoView R200于 2018 年被推出后,，便引起了外泌體領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注,，目前在全球已近100 多個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用該技術(shù)，發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)百篇,。本文選取了3 篇在高水平期刊《Journal of Extracellular Vesicle》（JEV）發(fā)表的比較有代表性的文章,，來(lái)說(shuō)明 ExoView在外泌體的表面電荷,、內(nèi)源性釋放的腫瘤源性外泌體、腺相關(guān)病毒載體等研究領(lǐng)域的具體應(yīng)用。
美國(guó) NanoView Biosciences 公司推出的全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng) ExoView R200系統(tǒng)，采用了特殊的 SP-IRIS 成像技術(shù),，只需要少量樣品即可一次完成外泌體計(jì)數(shù),、粒徑、蛋白表達(dá),、蛋白共定位,、亞群分布的分析。全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng) ExoView R200于 2018 年被推出后,，便引起了外泌體領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注,，目前在全球已近100 多個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用該技術(shù)，發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)百篇,。本文選取了3 篇在高水平期刊《Journal of Extracellular Vesicle》（JEV）發(fā)表的比較有代表性的文章,，來(lái)說(shuō)明 ExoView在外泌體的表面電荷,、內(nèi)源性釋放的腫瘤源性外泌體、腺相關(guān)病毒載體等研究領(lǐng)域的具體應(yīng)用。
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全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng) ExoView 系統(tǒng)
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? 決定外泌體表面電荷的關(guān)鍵因素
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外泌體在生命科學(xué)系統(tǒng)的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，但是由于其不確定性導(dǎo)致開(kāi)發(fā)外泌體診斷方法以及治療方法更加艱巨和復(fù)雜,。早先研究證明外泌體帶有負(fù)電荷，而且可通過(guò)經(jīng)典方法計(jì)算外泌體的zeta 電位,，但是這些研究忽略了外泌體表面緊密結(jié)合的離子的影響，低估了納米級(jí)別的zeta電位,，而且目前還未有系統(tǒng)地量化研究外泌體的表面電荷,。Sara Hassanpour Tamrin[3]等考慮到緊密結(jié)合的離子的影響，通過(guò)對(duì)外泌體的電泳遷移率,、 zeta 電位以及價(jià)態(tài)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析來(lái)準(zhǔn)確分析外泌體的表面電荷,，這有助于開(kāi)發(fā)外泌體的診斷和治療方法。
研究人員將實(shí)驗(yàn)樣本分成三組,，分別是從脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 ( AMSCs )的培養(yǎng)上清液中提取外泌體的樣本組（isolated EV fractions）,，培養(yǎng)上清液組（culture supernatant）以及新鮮培養(yǎng)基組（ fresh culture medium），后兩組為對(duì)照組,。與ExoView芯片上 CD63 抗體結(jié)合的外泌體的熒光強(qiáng)度與直徑的對(duì)比分析散點(diǎn)圖顯示,，被捕獲的樣品組外泌體的平均直徑為56 ± 8 nm(圖 1A)。此外,，研究人員通過(guò)標(biāo)記外泌體相關(guān)表面標(biāo)記物（CD81,、CD63 和 CD9）、內(nèi)容物Syntenin-1和非外泌體的細(xì)胞碎片的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物GRP94,，分析了樣品組顆粒的組分,；ExoView 結(jié)果表明四跨膜蛋白 CD9、CD81 和 CD63 存在于樣品組中（圖 1B）,，內(nèi)容物標(biāo)記物Syntenin-1表達(dá)水平非常明顯,，而作為外泌體陰性標(biāo)記物GRP94 的表達(dá)處于非常低的水平（圖 1C）。另外,，被CD63 抗體捕獲的外泌體的蛋白共定位餅圖顯示樣品組中存在大量共定位外泌體,，這些顆粒至少表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)特異性生物標(biāo)記物（圖1D）?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明樣品組含有大量的外泌體。除此之外,，樣本組，培養(yǎng)上清液組,、新鮮培養(yǎng)基組的共定位分析（圖2A-C）闡明新鮮培養(yǎng)基組幾乎沒(méi)有共定位顆粒,，而樣本組的共定位顆粒比例比培養(yǎng)上清液組更大,。
研究人員將實(shí)驗(yàn)樣本分成三組,，分別是從脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 ( AMSCs )的培養(yǎng)上清液中提取外泌體的樣本組（isolated EV fractions）,，培養(yǎng)上清液組（culture supernatant）以及新鮮培養(yǎng)基組（ fresh culture medium），后兩組為對(duì)照組,。與ExoView芯片上 CD63 抗體結(jié)合的外泌體的熒光強(qiáng)度與直徑的對(duì)比分析散點(diǎn)圖顯示,，被捕獲的樣品組外泌體的平均直徑為56 ± 8 nm(圖 1A)。此外,，研究人員通過(guò)標(biāo)記外泌體相關(guān)表面標(biāo)記物（CD81,、CD63 和 CD9）、內(nèi)容物Syntenin-1和非外泌體的細(xì)胞碎片的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物GRP94,，分析了樣品組顆粒的組分,；ExoView 結(jié)果表明四跨膜蛋白 CD9、CD81 和 CD63 存在于樣品組中（圖 1B）,，內(nèi)容物標(biāo)記物Syntenin-1表達(dá)水平非常明顯,，而作為外泌體陰性標(biāo)記物GRP94 的表達(dá)處于非常低的水平（圖 1C）。另外,，被CD63 抗體捕獲的外泌體的蛋白共定位餅圖顯示樣品組中存在大量共定位外泌體,，這些顆粒至少表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)特異性生物標(biāo)記物（圖1D）?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明樣品組含有大量的外泌體。除此之外,，樣本組，培養(yǎng)上清液組,、新鮮培養(yǎng)基組的共定位分析（圖2A-C）闡明新鮮培養(yǎng)基組幾乎沒(méi)有共定位顆粒,，而樣本組的共定位顆粒比例比培養(yǎng)上清液組更大,。
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圖1 ExoView檢測(cè) AMSCs樣本組的外泌體的熒光強(qiáng)度與直徑的對(duì)比、數(shù)量和進(jìn)行共定位分析
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圖2 ExoView對(duì) AMSCs樣本組,、培養(yǎng)上清液組以及新鮮培養(yǎng)基組進(jìn)行共定位分析
? 在轉(zhuǎn)移前生態(tài)位捕獲異種移植腫瘤內(nèi)源性釋放的外泌體可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)
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早前研究證明腫瘤源性外泌體（ TEV ）有助于轉(zhuǎn)移前生態(tài)位（ PMN ）的形成,，然而尚未有研究系統(tǒng)地分析 PMN 響應(yīng)內(nèi)源釋放 TEV 形成的動(dòng)力學(xué)。Laurence Blavier[1]等在小鼠體內(nèi)原位植入轉(zhuǎn)移性人類(lèi)黑色素瘤 ( MEL ) 和神經(jīng)母細(xì)胞瘤 ( NB ) 細(xì)胞,，通過(guò) GFP 標(biāo)記內(nèi)源性釋放的 TEV 以及它們被宿主細(xì)胞捕獲,，揭示了 TEV 對(duì)轉(zhuǎn)移的重要作用。另外,，TEV 在未來(lái)轉(zhuǎn)移部位的捕獲與 miR-1246 向肺巨噬細(xì)胞,、肝巨噬細(xì)胞和星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究人員證明在PMN捕獲內(nèi)源性釋放的 TEV 具有器官親和性,，TEV 誘導(dǎo)了炎癥基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,，使其變?yōu)榇倌[瘤反應(yīng)。
其中,，研究人員使用ExoView對(duì)從植入MEL 和 NB 的小鼠和對(duì)照組小鼠的血漿分離的外泌體進(jìn)行檢測(cè),，結(jié)果顯示樣品組中被人源 CD63、CD81,、CD9抗體捕獲的外泌體數(shù)量明顯多于對(duì)照組,，而且人源 CD63和 CD81抗體捕獲的外泌體數(shù)量也明顯高于CD9抗體捕獲的外泌體數(shù)量，這表明樣品組存在大量人源外泌體,，而對(duì)照組幾乎檢測(cè)不到,。
其中,，研究人員使用ExoView對(duì)從植入MEL 和 NB 的小鼠和對(duì)照組小鼠的血漿分離的外泌體進(jìn)行檢測(cè),，結(jié)果顯示樣品組中被人源 CD63、CD81,、CD9抗體捕獲的外泌體數(shù)量明顯多于對(duì)照組,，而且人源 CD63和 CD81抗體捕獲的外泌體數(shù)量也明顯高于CD9抗體捕獲的外泌體數(shù)量，這表明樣品組存在大量人源外泌體,，而對(duì)照組幾乎檢測(cè)不到,。
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圖 3 ExoView 檢測(cè)從植入MEL和NB的小鼠和對(duì)照組小鼠的血漿分離的外泌體的數(shù)量
? 氣管內(nèi)給藥后，外泌體可增強(qiáng)穩(wěn)定結(jié)合的腺相關(guān)病毒的肺轉(zhuǎn)導(dǎo)
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腺相關(guān)病毒 (AAV) 載體在臨床研究已獲得多項(xiàng)突破,，但由于難以轉(zhuǎn)導(dǎo)肺氣道細(xì)胞,，AAV載體在吸入基因治療中的臨床應(yīng)用仍未被破解。Gijung Kwak[2]等研究發(fā)現(xiàn)與 AAV血清型6（AAV6）的標(biāo)準(zhǔn)制劑相比,， AAV6 與外泌體（EV）制備的載體（EVAAV6）在原代人支氣管,、鼻上皮細(xì)胞以及小鼠肺氣道的粘液覆蓋的氣液界面(ALI) 培養(yǎng)物中展示了明顯更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，并且 EVAAV6 的出色功能是基于外泌體可促進(jìn)粘液滲透和 AAV6 進(jìn)入和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的能力,。
Gijung Kwak等使用ExoView對(duì) EVAAV6 組和對(duì)照組中的外泌體表型進(jìn)行分析,。在實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用四跨膜蛋白CD81,、CD63,、CD9的特異性抗體對(duì)樣品中的外泌體進(jìn)行捕獲，之后用CD63,、CD9,、內(nèi)容物syntenin-1的熒光抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記。結(jié)果顯示的EVAAV6 組和對(duì)照組中的外泌體在被四跨膜蛋白CD81、CD63,、CD9 抗體捕獲后表現(xiàn)出相似的syntenin-1表達(dá)水平,。另外，四跨膜蛋白的 CD63,、CD9 的熒光表達(dá)水平在兩組中也呈現(xiàn)接近的趨勢(shì),。總之,，外泌體是 EVAAV6 組和對(duì)照組的主要組分,。
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圖 4 ExoView 檢測(cè) EVAAV6 組和對(duì)照組的外泌體的表型和數(shù)量
在上述 3 篇文章中，科學(xué)家借助美國(guó)NanoView Biosciences 公司研發(fā)的全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)ExoView,，直接檢測(cè)樣本中的外泌體,，無(wú)需純化，操作簡(jiǎn)單,。一次結(jié)果直接輸出外泌體粒徑,，絕對(duì)數(shù)目，蛋白表型,，不同亞群的含量,、多色熒光成像圖。3 篇文章分別從外泌體的表面電荷,、內(nèi)源性釋放的腫瘤源性外泌體,、腺相關(guān)病毒載體等研究領(lǐng)域介紹了 ExoView 的無(wú)需純化，全面表征的特點(diǎn),，有力地證明 ExoView 是外泌體檢測(cè)的一大利器,。
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■ 南方醫(yī)科大學(xué)在《Chemical Engineering Journal 》發(fā)表文章
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■ 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院在《Bioengineering & Translational Medicine 》發(fā)表文章
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■ 上海大學(xué)在《Journal of extracellular vesicles 》發(fā)表文章
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■ 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院在《Lab on a Chip 》發(fā)表文章
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■ 北京天壇醫(yī)院,、國(guó)家納米科學(xué)中心,、北京航空航天大學(xué)在《Advanced Science 》發(fā)表文章
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■ 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院、上海思路迪轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)在《Journal of Nanobiotechnology 》發(fā)表文章
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■ 山東千佛山醫(yī)院在《NANO LETTERS 》發(fā)表文章
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■ 陜西師范大學(xué)在《Food & Function 》發(fā)表文章
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■ 南京大學(xué)在《Frontiers in Cell and Developmental Biology 》發(fā)表文章
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參考文獻(xiàn)：
[1] Sara Hassanpour Tamrin ...& Arindom Sen. (2023) Critical considerations in determining the surface charge of small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles, 12:12353.
[2] Laurence Blavier ...& Yves A. DeClerck. (2023) The capture of extracellular vesicles endogenously released by xenotransplanted tumours induces an inflammatory reaction in the premetastatic niche. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12326.
[3] Gijung Kwak ...& Jung Soo Suk. (2023) Extracellular vesicles enhance pulmonary transduction of stably associated adeno-associated virus following intratracheal administration. Journal of Extracellular Vesicles, 12:12324.
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