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mRNA藥物是通過將編碼抗原蛋白的mRNA接種到人體,，利用人體細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)進行表達合成抗原蛋白,，通過抗原蛋白誘導和激活機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應,，從而達到預防和治療疾病的目的,。
由于其具有較低的感染和突變風險，能夠同時誘導產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫,，免疫效能好,，研發(fā)和生產(chǎn)周期短，容易實現(xiàn)量產(chǎn)等特點,，目前被廣泛用于傳染性疾病,、腫瘤及罕見病藥物的研發(fā)。
通過酶促體外轉(zhuǎn)錄法制備大量mRNA的工藝已經(jīng)成熟,，其中規(guī)?；a(chǎn)過程中主要涉及的工具酶有T7 RNA Polymerase、DNase Ⅰ,、RNase Inhibitor,、無機焦磷酸酶等，這些酶的靈活使用極大的方便了生產(chǎn)流程,，加速科學家們研究進展,。
T7 RNA聚合酶是由T7噬菌體DNA編碼的,，一種DNA依賴性的RNA聚合酶,，具有高度啟動子專一性，可催化以T7啟動子序列為起點 5’→ 3’方向的RNA合成,，在mRNA藥物研發(fā)中常以其催化目的基因的體外合成,，轉(zhuǎn)錄效率和產(chǎn)量高，市面上由其催化的1μg DNA模板可轉(zhuǎn)錄出150-200μg的RNA,。
脫氧核糖核酸酶I,，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶，可以用于各種RNA樣品的處理,，消化由T7 RNA聚合酶催化的體外轉(zhuǎn)錄后的DNA模板,，65℃加熱10分鐘可使DNaseI失活,。
RNase（Ribonuclease，核糖核酸酶）是一類能夠催化RNA降解為小分子RNA的核酸酶,，廣泛存在于真核,、原核生物的所有細胞和組織中，通常有強活性,，RNA樣本中微量的RNase污染足以導致其降解,。為了減少RNA的損失，適當添加RNase抑制劑（RNase inhibitor）是有必要的,。
RNase抑制劑是人的胎盤中存在的一種特異性核糖核酸酶(RNase)抑制劑,，能夠特異地與RNase以非共價鍵結(jié)合形成復合體從而使RNase失活。
多種代謝反應會產(chǎn)生無機焦磷酸,，Pyrophosphatas無機焦磷酸酶（PPase）可水解無機焦磷酸鹽,，可以避免無機焦磷酸對反應的抑制，并且提供熱力學動力促使反應向正向進行,，從而常用于RNA體外轉(zhuǎn)錄,、DNA復制和擴增如HDA或LAMP等溫擴增等。
尤其在工業(yè)化生產(chǎn)mRNA疫苗的時候會產(chǎn)生大量的無機焦磷酸鹽,，為了保證mRNA疫苗高效生產(chǎn),，可以添加無機焦磷酸酶，解除生成的無機焦磷酸鹽對反應體系的抑制,。
大多數(shù)工具酶的使用能幫助我們獲得大量的RNA，但工具酶本身對于藥物成品來說亦是一種雜質(zhì),，這些雜質(zhì)與mRNA一起通過LNP包封進入細胞釋放后,，極有可能產(chǎn)生高強度的免疫原性從而連帶引發(fā)mRNA的降解。以及產(chǎn)生的雙鏈RNA (dsRNA)雜質(zhì)具有潛在的免疫原性,，對患者有害,。因此，mRNA相關(guān)制品需要測定和控制工具酶和dsRNA的含量,。
——mRNA類的質(zhì)量標準可以納入外觀,、pH值、含量,、鑒別,、序列分析,、mRNA完整性、加帽率,、poly（ A）長度及分布,、生物學活性、無菌檢測,、細菌內(nèi)毒素,、雙鏈 RNA殘留、溶劑殘留等檢測項目,。
體外基因修飾系統(tǒng)藥學研究與評價技術(shù)知道原則（試行）
--2022年05月
——mRNA等通過體外轉(zhuǎn)錄方式制備的核酸產(chǎn)品,，可通過對原材料、轉(zhuǎn)錄模板和轉(zhuǎn)錄條件的研究,，控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的質(zhì)量,。轉(zhuǎn)錄用的重要原材料，如核苷酸,、修飾核苷酸,、 5’-帽或類似物、工具酶（如轉(zhuǎn)錄酶等）等應進行適當?shù)馁|(zhì)量控制,，可關(guān)注其純度和雜質(zhì),，轉(zhuǎn)錄酶還需關(guān)注其保真度等。
轉(zhuǎn)錄模板的制備應能確保模板的序列準確性和純度,，減少雜質(zhì)殘留,。體外轉(zhuǎn)錄條件應經(jīng)過充分的研究，提高轉(zhuǎn)錄序列的準確性,、均一性和完整性,， 減少副反應產(chǎn)物，如不完整 RNA,、雙鏈RNA,、截短RNA、長鏈RNA等的形成,。
體內(nèi)基因修飾系統(tǒng)藥學研究與評價技術(shù)指導原則（試行）
--2022年05月
CDE發(fā)布的指導原則《病毒預防用mRNA疫苗藥學研究技術(shù)指導原則（試行）》以及美國藥典（USP）發(fā)布的《mRNA疫苗質(zhì)量分析方法》的指南草案中（見下圖）指出:需要對整個工藝進行質(zhì)量控制,，保證質(zhì)量有效、安全可控,。
其指導原則中還規(guī)定,，需要對其生產(chǎn)工藝相關(guān)雜質(zhì)進行檢測，對主要雜質(zhì)進行監(jiān)測與分析,，需要更強大的評估方法來確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量和安全,。其中對T7 RNA和dsRNA的殘留進行了明確規(guī)定。
疫苗行業(yè)
美國藥典(USP)發(fā)布的《mRNA疫苗質(zhì)量分析方法》指南草案
由于mRNA技術(shù)的應用相對較新,，在藥物研發(fā)和制造過程中指導mRNA質(zhì)量研究與控制方面的監(jiān)管指南和行業(yè)標準仍在不斷發(fā)展,。
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