一,、實驗?zāi)康模?nbsp;掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)
二、PCR反應(yīng)實驗原理
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),可以選擇性擴增一段DNA序列,。其基本步驟是,首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈,,DNA樣品中,,特異性的引物能夠與其互補的序列雜交,在dNTPs和Taq酶存在時,,就可以合成模板DNA的互補鏈,,反應(yīng)完成后,將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性,,溫度下降后,,過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次,,使所需要的DNA片段得到特異性的擴增,。
1. 變性:加熱使模板DNA在高溫下(94℃)變性,雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火:使溶液溫度降至50~60℃,,模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合.
3. 延伸:溶液反應(yīng)溫度升至72℃,,耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,在引物的引導(dǎo)下,,利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸(dNTPs),,按5ˊ→3ˊ方向復(fù)制出互補DNA。
上述3步為一個循環(huán),,即高溫變性,、低溫退火、中溫延伸3個階段,。從理論上講,,每經(jīng)過一個循環(huán),樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍,,新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板,,經(jīng)過25~30個循環(huán)后DNA可擴增106~109倍。
典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成:DNA模板,、反應(yīng)緩沖液,、dNTPs,、MgCl2、兩個合成的DNA引物,、耐熱Taq聚合酶,。
三、 試劑和緩沖液
PCR mix,,10×PCR Buffer,,引物,模板,。
四,、 儀器耗材
PCR儀,掌上離心機,,微量移液器,,槍頭,1.5mL離心管,,PCR管,,冰盒。
五,、 實驗步驟(每人一組,,每人做1管,純化時兩人一組)
1. 查找基因序列,,設(shè)計合成PCR引物,。注意合成引物約需一周時間,請?zhí)崆皽?zhǔn)備,。詳細(xì)步驟請參考實驗一后面的附件內(nèi)容,。
2. 在50μL反應(yīng)體系中,加入:
模板DNA (5ng/μL) 1
引物P1P2 (10μmol/L) 各1
2×PCR mix 25
ddH2O 22
在冰上配制,,注意混勻后離心,。加入10μL石蠟油覆蓋。
3. 在PCR儀中預(yù)變性94℃ 4min,,然后循環(huán):94℃ 30s,,55℃ 30s,72℃ 60s,,30個循環(huán),;循環(huán)結(jié)束后,72℃10min ,。擴增的PCR產(chǎn)物4℃保存,。(OC-II)
4. 取PCR產(chǎn)物2-5μL與上樣緩沖液混合,點樣,。
5. 1% 瓊脂糖膠電泳,,160V 30-40min,。
6. 電泳結(jié)束,溴化乙錠染色5-10分鐘,。
7. 用凝膠成像儀觀察、拍照,。
8. PCR產(chǎn)物切膠回收,。步驟參見膠回收Kit說明書。
A 酶切片段的純化及其回收
使用切膠回收kit進行PCR產(chǎn)物的回收,。具體操作步驟如下,,詳見說明書。
1)稱回收的膠,,每0.1g加100µL XP2 ,;
2)55度5-7分鐘至溶膠 ;
3)取溶膠液加入回收柱子,,最大體積700µL,;10000g, 1min;
4) 加300µl XP2 ,,10000g 1min,;
5)加700µl SPW ,10000g 1min,;
6)重復(fù)5),;
7)空管離心2min,13000 g
8)干燥,,加15-30µL Eulation Buffer
9)13000 g,,1min
DNA產(chǎn)物純化kit,操作步驟:
● 將PCR反應(yīng)液(40ul)或酶促反應(yīng)液移至一干凈的1.5ml離心管中,,加入5倍體積的buffer3,,充分混勻。(用前確定加入適量的異丙醇)
● 將混合液全部移入吸附柱,,8000g離心30s,;將濾出液再次加入到吸附柱中再次過柱,8000g離心30s(此步驟可以提高回收效率),;倒掉收集管中的液體,,將吸附柱放入同一收集管中。
● 向吸附柱中加入500ul Wash Solution(加到壁上),,9000g離心30s,。倒掉收集管中的液體,將吸附柱放入同一收集管中,。(Wash Solution使用前請檢查是否已加入正確量的無水乙醇)
● 重復(fù)步驟3一次
● 將空吸附柱和收集管放入離心機,,9000g離心1min,。下管扔掉,上管放入1.5ml離心管中,,晾干,。(殘余的乙醇會嚴(yán)重影響得率和后續(xù)試驗)
● 在吸附膜中央加入25ul 60℃提前預(yù)熱(進一步提高得率)的Elution Buffer(加到濾芯上),室溫靜置1min,,9000g離心1min,。將所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后續(xù)試驗。 注意:本步驟中,,所有轉(zhuǎn)速單位為g,。
B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法對PCR產(chǎn)物回收。具體操作步驟如下,。
● 加入等體積的冰無水乙醇,,加入1/10體積的KAc(3M pH5.2)。
● 上下顛倒混勻,,-20℃30min,;12000r/min 4℃ 10min。
● 棄上清,,加入70%的冰乙醇,,輕輕混勻。12000r/min 4℃離心10min,。
● 棄上清,,室溫干燥,至無乙醇,。
● 加入適量體積的ddH2O,。
六、注意事項
1. 進行PCR反應(yīng)時,,注意加入試劑的順序,。注意加入任何一種試劑后均需混勻。
2. 本實驗使用2xPCR mix,,包含有dNTPs和Taq酶,。
3. 引物的稀釋:分子量24bp*324.5 = 7788,質(zhì)量數(shù)10OD*33 =33ug,,摩爾數(shù)=33/7788 =4.2 nmol,,母液濃度4.2 n mol / 84μL H2O = 50μmol/L,使用時取母液稀釋5倍,,則終濃度為10μmol/L,。
4. PCR擴增產(chǎn)物共20μL,其中2-5 μL用于檢測,,剩余的用于純化回收,。
5. 使用自己的實驗材料進行PCR擴增的學(xué)生,,請?zhí)崆皽?zhǔn)備引物和模板。
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