一,、實驗?zāi)康模?nbsp;掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)

二、PCR反應(yīng)實驗原理
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以選擇性擴增一段DNA序列,。其基本步驟是，首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈,，DNA樣品中,，特異性的引物能夠與其互補的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時,，就可以合成模板DNA的互補鏈,，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性,，溫度下降后,，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次,，使所需要的DNA片段得到特異性的擴增,。
1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火：使溶液溫度降至50～60℃,，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合.
3. 延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72℃,，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下,，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）,，按5ˊ→3ˊ方向復(fù)制出互補DNA。

上述3步為一個循環(huán),，即高溫變性,、低溫退火、中溫延伸3個階段,。從理論上講,，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍,，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板,，經(jīng)過25～30個循環(huán)后DNA可擴增10⁶～10⁹倍。
   
典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板,、反應(yīng)緩沖液,、dNTPs,、MgCl₂、兩個合成的DNA引物,、耐熱Taq聚合酶,。

三、 試劑和緩沖液
PCR mix,，10×PCR Buffer,，引物，模板,。

四,、 儀器耗材
PCR儀，掌上離心機,，微量移液器,，槍頭，1.5mL離心管,，PCR管,，冰盒。

五,、 實驗步驟（每人一組,，每人做1管，純化時兩人一組）
1. 查找基因序列,，設(shè)計合成PCR引物,。注意合成引物約需一周時間，請?zhí)崆皽?zhǔn)備,。詳細(xì)步驟請參考實驗一后面的附件內(nèi)容,。
2. 在50μL反應(yīng)體系中，加入：
　　　　模板DNA (5ng/μL)        1   
　　　　引物P₁P₂ (10μmol/L)    各1   
　　　　2×PCR mix              25 
　　　　ddH₂O                  22 
在冰上配制,，注意混勻后離心,。加入10μL石蠟油覆蓋。
3. 在PCR儀中預(yù)變性94℃ 4min,，然后循環(huán)：94℃ 30s,，55℃ 30s，72℃ 60s,，30個循環(huán),；循環(huán)結(jié)束后，72℃10min ,。擴增的PCR產(chǎn)物4℃保存,。（OC-II）
4. 取PCR產(chǎn)物2-5μL與上樣緩沖液混合，點樣,。
5. 1% 瓊脂糖膠電泳,，160V 30-40min,。
6. 電泳結(jié)束，溴化乙錠染色5-10分鐘,。
7. 用凝膠成像儀觀察、拍照,。
8. PCR產(chǎn)物切膠回收,。步驟參見膠回收Kit說明書。

A 酶切片段的純化及其回收
使用切膠回收kit進行PCR產(chǎn)物的回收,。具體操作步驟如下,，詳見說明書。
1）稱回收的膠,，每0.1g加100µL XP2 ,；
2）55度5-7分鐘至溶膠 ；
3）取溶膠液加入回收柱子,，最大體積700µL,；10000g, 1min；
4) 加300µl XP2 ,，10000g 1min,；
5）加700µl SPW ，10000g 1min,；
6）重復(fù)5）,；
7）空管離心2min，13000 g
8）干燥,，加15-30µL  Eulation Buffer
9）13000 g,，1min

DNA產(chǎn)物純化kit，操作步驟：
● 將PCR反應(yīng)液（40ul）或酶促反應(yīng)液移至一干凈的1.5ml離心管中,，加入5倍體積的buffer3,，充分混勻。（用前確定加入適量的異丙醇）
● 將混合液全部移入吸附柱,，8000g離心30s,；將濾出液再次加入到吸附柱中再次過柱，8000g離心30s（此步驟可以提高回收效率）,；倒掉收集管中的液體,，將吸附柱放入同一收集管中。
● 向吸附柱中加入500ul Wash Solution（加到壁上）,，9000g離心30s,。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中,。（Wash Solution使用前請檢查是否已加入正確量的無水乙醇）
● 重復(fù)步驟3一次
● 將空吸附柱和收集管放入離心機,，9000g離心1min,。下管扔掉，上管放入1.5ml離心管中,，晾干,。（殘余的乙醇會嚴(yán)重影響得率和后續(xù)試驗）
● 在吸附膜中央加入25ul 60℃提前預(yù)熱（進一步提高得率）的Elution Buffer（加到濾芯上），室溫靜置1min,，9000g離心1min,。將所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后續(xù)試驗。 注意：本步驟中,，所有轉(zhuǎn)速單位為g,。

B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法對PCR產(chǎn)物回收。具體操作步驟如下,。
● 加入等體積的冰無水乙醇,，加入1/10體積的KAc（3M  pH5.2）。
● 上下顛倒混勻,，-20℃30min,；12000r/min 4℃ 10min。
● 棄上清,，加入70%的冰乙醇,，輕輕混勻。12000r/min 4℃離心10min,。
● 棄上清,，室溫干燥，至無乙醇,。
● 加入適量體積的ddH2O,。

六、注意事項
1. 進行PCR反應(yīng)時,，注意加入試劑的順序,。注意加入任何一種試劑后均需混勻。
2. 本實驗使用2xPCR mix,，包含有dNTPs和Taq酶,。
3. 引物的稀釋：分子量24bp*324.5 = 7788，質(zhì)量數(shù)10OD*33 ＝33ug,，摩爾數(shù)=33/7788 =4.2 nmol,，母液濃度4.2 n mol / 84μL H₂O = 50μmol/L，使用時取母液稀釋5倍,，則終濃度為10μmol/L,。
4. PCR擴增產(chǎn)物共20μL，其中2-5 μL用于檢測,，剩余的用于純化回收,。
5. 使用自己的實驗材料進行PCR擴增的學(xué)生,，請?zhí)崆皽?zhǔn)備引物和模板。