PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間
　　一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測,，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失,。

假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
　　PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,，②引物的質(zhì)量與特異性,，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件,。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究,。
　　模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑,，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈,，特別是染色體中的組蛋白,，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚,。⑤模板核酸變性,。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,，極有可能是標(biāo)本的消化處 理,，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改,。
　　酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用,，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性,。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠,。
　　引物：引物質(zhì)量,、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想,、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,，兩條引物一條濃度高,，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增,，對策為：①選定一個好的引物合成單 位,。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有引物條帶出現(xiàn),，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶,，一條引物無條 帶,，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高,，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度,。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效,。④引物設(shè)計不合理,，如引物長度不 夠,，引物之間形成二聚體等。
　　Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性,，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶?！　?br/>　　反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul,、30ul、50ul,?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,，在做小體積如20ul 后，再做大體積時,，一定要模索條件,，否則容易失敗?！　?br/>　　物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,，如變性溫度低，變性時間短,，極有可能出 現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計,，檢測一下 擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一,。