在細胞培養(yǎng)過程中，去除原培養(yǎng)基并將細胞從原培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中,，維持細胞的活力與增殖,。細胞傳代既可以擴大細胞培養(yǎng)量，也能夠避免細胞因進入平臺期而出現(xiàn)生長抑制甚至死亡的情況,。那么你知道細胞傳代的實驗步驟是什么嗎,？有何注意事項呢？讓我們一起來看看吧,！

一,、實驗步驟

1. 貼壁細胞的傳代:

1) 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及密度，評估細胞的狀態(tài)，以作為傳代比例的參考,。

2) 提前紫外殺菌（至少30min為宜）操作臺及實驗材料,。

3) 注意無菌操作，在操作臺中吸除或倒掉培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)液（盡可能去除干凈,，鈣離子,、鎂離子和血清蛋白的存在會降低胰酶活力）。

4) 加入適量PBS緩沖液洗滌1~2次,。

5) 加入1~2 mL胰酶（以全部覆蓋細胞為準）,，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使胰酶充分接觸細胞（建議：胰酶分裝成適量,，提前水浴復溫到37℃）,。

6) 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞，當細胞變圓且大多數(shù)細胞脫落時,，表明此時細胞消化適度（加入胰酶后,，邊計時邊顯微鏡下觀察，記錄細胞消化的時間,，供今后細胞消化參考）

7) 加入2~3 mL 含血清完quan培養(yǎng)液（也可以考慮使用該細胞本次的培養(yǎng)上清）,，終止消化，輕柔吹打,，使細胞完quan脫落,。

8) 收集細胞懸液，轉(zhuǎn)移至離心管中,，1500 rpm 離心5 min（必要時可以考慮,，低速、短時間的離心有助于去除細胞碎片,、細菌污染等）,。

9) 棄去上清液，加入適量體積含血清培養(yǎng)液,，重懸細胞,，根據(jù)細胞生長速度、是否有密度依賴性及計劃傳代的時間等特點,，按照比例將細胞懸液分裝入2個或多個無菌培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶內(nèi),，培養(yǎng)皿內(nèi)可預先加入適量培養(yǎng)基。注意細胞充分混勻,，保證細胞均勻分布,。 

2. 懸浮細胞的傳代：可通過離心收集后用含血清的培養(yǎng)基直接傳代。

二,、注意事項

1. 嚴格無菌操作,！

2. 適度消化：提前復溫胰酶37℃以及消化計時,，易保證消化過程穩(wěn)定。消化時間過長,，容易影響細胞狀態(tài)及活性,，消化時間過短易多細胞成團，影響實驗效果,。

3.吹打過程要輕柔,，避免細胞液的灑濺。

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