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色譜又稱色層法或?qū)游龇?，是一種物理化學(xué)分析方法,，它利用不同溶質(zhì)(樣品)與固定相和流動相之間的作用力(分配、吸附,、離子交換等)的差別，當(dāng)兩相做相對移動時,，各溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行多次平衡,，使各溶質(zhì)達(dá)到相互分離。
流動相因素
1.流動相pH
不同基質(zhì)的填料具有不同的pH適用范圍,。常溫下無定形硅膠在純水中的溶解度約為100mg·L-1,，且在pH1～9的范圍內(nèi)溶解的硅膠量幾乎是常量，考慮到溶解速度的影響,對于硅膠基質(zhì)的填料,其所能承受的流動相pH范圍約為1～8,。鍵合相硅膠填料則由于鍵合層的屏蔽作用,使填料對流動相的適應(yīng)范圍大大增加,，如現(xiàn)在廣泛使用的反相色譜填料C18(十八烷基硅烷鍵合硅膠)，其pH適用范圍可達(dá)2～10,。當(dāng)流動相pH值超出酸性范圍時,，鍵合相易發(fā)生水解而流失；當(dāng)流動相pH超出堿性范圍時,，會加速硅膠的溶解而釋放出絮狀物堵塞柱子,，這兩種反應(yīng)均是不可逆反應(yīng)，特別是在溫度較高（>40℃）的環(huán)境下,，會使柱效迅速降低而報廢,。
2.流動相變質(zhì)
當(dāng)前使用最為廣泛的是硅基鍵合相填料，當(dāng)以水溶液作為流動相或流動相中含有一定濃度的磷酸鹽緩沖液時,，水溶液中或緩沖鹽溶液中會滋生出一些細(xì)菌或霉菌,，從而堵塞固定相顆粒間的空隙。特別是對于多元自動比例混合的高效液相色譜儀來說,水相或緩沖鹽相獨立存貯,，因存放時間較長而容易發(fā)生此類問題,。
3.流動相純度
目前，廣泛使用的填料顆粒粒徑范圍在3～10μm,孔徑在6～10nm,色譜柱在使用中會有大量的流動相通過,如流動相含有微量不溶性雜質(zhì)顆粒,則很容易在柱頭部位被截留,久而久之,造成色譜柱機械性堵塞,引起柱壓升高而無法正常使用。
色譜柱的注意事項：
1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動,。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況,；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此,，在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進(jìn)行,，在閥進(jìn)樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。
2.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,，特別是反相色譜中,，不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?/div>
3.一般說來色譜柱不能反沖,，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時,，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效,。
4.選擇使用適宜的流動相(尤其是pH),，以避免固定相被破壞。有時可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱,，分析柱是鍵合硅膠時,，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”,，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解,。
5.經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì),。在進(jìn)行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡,，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,。
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