1.什么是雜交瘤測序

雜交瘤細胞抗體基因測序是指使用專業(yè)的兼并引物設計（degenerate primer）和測序方案,，同時優(yōu)化經(jīng)濟成本和時間成本,，為客戶提供快速準確的抗體可變區(qū)域以及全長基因測序服務。

圖1：雜交瘤測序

2.雜交瘤測序目的

雜交瘤細胞在保存過程中存在抗體基因丟失,、細胞狀態(tài)不好影響抗體產(chǎn)生,，甚至細胞死亡的情況，為將優(yōu)秀抗體長期保存,、穩(wěn)定生產(chǎn),，可將雜交瘤細胞中的抗體基因提取并測序，最終拿到核苷酸序列,，并以 DNA 形式保存,，用于后期外源表達及生產(chǎn)。

3.雜交瘤測序應用

雜交瘤細胞抗體測序所獲取的雜交瘤細胞單克隆抗體基因序列,，是發(fā)表文章和重組表達工程抗體的前提之一,，同時也是抗體人源化工作的基礎。

4.泰克生物能夠為客戶提供高質(zhì)量的雜交瘤測序服務

標準周期單克隆抗體測序服務：抗體可變區(qū)VH和VL測序、抗體VH,，VL和前導區(qū)測序,、全抗體VH，VL,，前導區(qū)和恒定區(qū)測序,，3-4周完成測序服務。

快速單克隆抗體測序服務：從目標細胞株快速識別的抗體序列,，可在10天內(nèi)獲得測序結果,。

5.泰克生物為客戶提供雜交瘤測序服務的全流程介紹

泰克生物為客戶提供雜交瘤測序服務，流程包括：RNA提取,，cDNA克隆,，T載體構建，抗體基因測序,，生物信息學分析,，項目報告。

圖2：雜交瘤測序流程

5.1雜交瘤生產(chǎn)和總RNA提取

根據(jù)制造商的說明,，使用TRIzol試劑從雜交瘤細胞中提取總RNA,。

5.2反轉(zhuǎn)錄合成抗體可變區(qū)cDNA

5.2.1反轉(zhuǎn)錄

使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，另外使用的是RNA樣本（來自小鼠抗體的雜交瘤RNA樣本或來自嵌合抗體RNA樣本）,、引物,、10 mM脫氧核苷酸三磷酸混合物（dNTPs)、H2O和80U/μLRNAse抑制劑,。注意：由于其RNA含量,，將模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸分裝并儲存在–80℃。

根據(jù)以下方案執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄：在操作期間將所有反應保持在冰上,。對于每個RNA樣品,，設置三個cDNA合成反應：一個用于kappa鏈，一個用于lambda鏈,，一個用于重鏈,。理想情況下，每個抗體只會擴增一條輕鏈,。

圖3：3H4 kappa 和 3H4 lambda 可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列比較

5.2.1.1 在PCR管中,，準備Mix 1：2μL 50ng/μL RNA、1μL 10μM基于抗體鏈的反向RT引物（例如用于小鼠抗體的mIGKRT,、mIGLRT或mIGHGRT）和1μL 10mM dNTP,。對于一個RNA樣本，需要三管Mix1,，每管包含不同的反向引物,。

5.2.1.2 在0.5mL Eppendorf管中,，配制Mix 2：1.95μL H₂O、2μL 5x SMARTScribe緩沖液,、1μL 20mM DTT和0.3μL 100μM模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸,。為Mix2提供的體積用于一個cDNA合成反應，因此根據(jù)需要進行放大,，即每個雜交瘤RNA樣品制備Mix 2體積的三倍,。為所有反應準備了Mix 2的一種主混合物。

5.2.1.3 通過在熱循環(huán)儀中將含有Mix 1的試管在72℃下孵育3分鐘,，使RNA二級結構變性,。

5.2.1.4在Mix 1變性期間，將以下物質(zhì)添加到Mix 2：每個cDNA合成反應0.25μL 80U/μL RNAse抑制劑和0.5μL 100U/μL SMARTScribe逆轉(zhuǎn)錄酶,。

5.2.1.5 將6μL Mix 2添加到每管變性Mix 1中,。

5.2.1.6在熱循環(huán)儀中，合并的混合物在42℃下孵育60分鐘,，然后在70℃下孵育5分鐘終止反應,。反應保持在4℃。逆轉(zhuǎn)錄后立即進行PCR擴增,。不需要cDNA純化步驟,。

5.2.2 抗體可變區(qū)的PCR擴增

5.2.2.1為每個cDNA合成設置PCR反應：10μL 5x PCR緩沖液，1μL 10mM dNTPs,，3μL RT反應合成的cDNA,，2.5μL 10μM通用正向引物ISPCR，2.5μL 10μM反向PCR引物在抗體鏈上（例如小鼠抗體的mIGKPCR,、mIGLPCR或mIGHGPCR）,、30.5μL H₂O和0.5μL 2U/μL Phusion聚合酶（或其他高保真聚合酶）。

5.2.2.2根據(jù)以下熱循環(huán)儀條件進行降壓/降壓PCR：98℃ 30秒,；98℃ 15秒、63–57.5℃ 30秒（每個循環(huán)降低溫度0.5℃）和72℃ 30秒的10個循環(huán),；98℃ 15秒,、56℃ 30秒、72℃ 30秒15個循環(huán),；隨后72℃ 7分鐘,；并保持在4℃。

5.2.2.3每個RT-PCR反應取5μL在90V的TAE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠上運行,。擴增的小鼠抗體產(chǎn)物出現(xiàn)在550-600個堿基對之間,。擴增的人抗體產(chǎn)物出現(xiàn)在750-850個堿基對之間。Quick Load Purple 2-Log DNA Ladder(NEB,N0550S)用作標準品,。

圖4：抗體可變區(qū)PCR擴增

5.3 T載體構建

使用Macherey-Nagel的PCR清理和凝膠提取試劑盒對RT-PCR反應進行PCR清理,。根據(jù)平末端克隆試劑盒手冊,，將2μL的每個PCR清洗的產(chǎn)物平末端克隆到pCR-Blunt-II-TOPO載體中。接下來,，將每個TOPO克隆反應的3μL轉(zhuǎn)化為化學感受態(tài)E.Coli,。將每個轉(zhuǎn)化的100μL涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，并在37℃下孵育過夜,。

5.4 抗體基因測序

獲得菌落后,，將每條抗體鏈5-10個菌落接種在5mL LB/卡那霉素培養(yǎng)基中，并在37℃下以250rpm搖動過夜,。這些培養(yǎng)物使用Macherey-Nagel的小量制備試劑盒進行小量制備,，所得質(zhì)粒DNA由Sequetech Corporation使用M13正向引物進行Sanger測序。

5.5生物信息學分析

使用 GitHub 上提供的自定義 Python 程序分析測序數(shù)據(jù),，去除非功能性的DNA,。

5.6項目報告

交付得到的抗體序列。

雜交瘤細胞單抗基因序列的獲取是進行重組抗體制備,，抗體藥開發(fā)的基礎,。泰克生物能夠準確熟練地對多物種來源的雜交瘤細胞進行序列測定,，服務包括小鼠雜交瘤細胞,，大鼠雜交瘤細胞,，兔雜交瘤細胞以及不同物種的重組單克隆抗體（通過噬菌體技術構建的單抗基因獲得）等。通過嚴格的質(zhì)量控制,，以確保高準確度。