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電轉(zhuǎn)效率低,?你可能忽略了這些

來(lái)源:上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司   2023年08月25日 09:59  

最近,,總有小伙伴們前來(lái)詢問在做完電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)后,,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率太低了該怎么辦,,于是小優(yōu)通過搜集多方資料,、詢問技術(shù)專家,,為大家找來(lái)了一些解決方案,,下面我們就來(lái)一起看看吧~

 

一,、什么是電轉(zhuǎn)?

俗話說(shuō)得好,,知己知彼,,方能百戰(zhàn)百勝,所以首先我們需要清楚電轉(zhuǎn)的原理,。電轉(zhuǎn),,也稱電穿孔法,是通過脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔,,將外源分子(DNA,、RNA 、mRNA等)導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi),,來(lái)改變細(xì)胞的特性,,從而達(dá)到改造細(xì)胞的目的,是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞基因功能和蛋白質(zhì)表達(dá)研究的重要工具,。與其他細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)相比,,電轉(zhuǎn)具有操作簡(jiǎn)便、適用多種細(xì)胞,、重復(fù)性好和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn),。

 

二、影響電轉(zhuǎn)效率的因素有哪些呢,?

影響電轉(zhuǎn)效率的因素有很多,,總結(jié)下來(lái)有三方面:電轉(zhuǎn)過程、細(xì)胞狀態(tài)以及轉(zhuǎn)染底物狀態(tài),。只有了解影響電轉(zhuǎn)效率的因素有哪些,,我們才能夠“對(duì)癥下藥”。

 

1.電轉(zhuǎn)過程

1)電轉(zhuǎn)的完整操作步驟包括電轉(zhuǎn)前操作,電轉(zhuǎn)執(zhí)行和電轉(zhuǎn)后培養(yǎng),。在進(jìn)行電轉(zhuǎn)前操作時(shí),電轉(zhuǎn)試劑,、細(xì)胞與轉(zhuǎn)染底物要進(jìn)行混勻,,如果混勻時(shí)過于激烈,會(huì)破壞轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成,,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低,;

2)在進(jìn)行電轉(zhuǎn)前操作時(shí),電擊緩沖液的選擇也很重要,,由于細(xì)胞對(duì)緩沖液的離子組成和滲透壓非常敏感,,因此組分與細(xì)胞質(zhì)類似的緩沖液有利于細(xì)胞電擊后的存活;

3)電轉(zhuǎn)執(zhí)行時(shí),,需要控制電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間,。適當(dāng)提高電場(chǎng)強(qiáng)度或延長(zhǎng)脈沖時(shí)間,能使底物更容易進(jìn)入細(xì)胞,,但細(xì)胞的死亡率也會(huì)增加,。一般電場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)置遵循低電場(chǎng)長(zhǎng)時(shí)程的原則。如果選擇內(nèi)置優(yōu)化程序的電轉(zhuǎn)系統(tǒng),,如Lonza的Nucleofector系統(tǒng),,則可以節(jié)省摸索電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間的步驟。

4)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中含有抗生素會(huì)影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,,這是因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有損傷,,這時(shí)培養(yǎng)基中的抗生素會(huì)進(jìn)一步損傷細(xì)胞,因此我們建議使用不含抗生素的培養(yǎng)基或PBS,;

5)電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)要注意,,如果使用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑,轉(zhuǎn)染后4-6h后必須進(jìn)行換液,,否則會(huì)由于轉(zhuǎn)染試劑毒性而引起細(xì)胞死亡,,最終影響轉(zhuǎn)染效率。

 

2.細(xì)胞狀態(tài)

1)細(xì)胞污染對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響很大,,受到細(xì)菌,、真菌或支原體污染的細(xì)胞都會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低、細(xì)胞死亡率增加,,尤其是支原體污染悄無(wú)聲息,,因此一定要做好定期的支原體檢測(cè),確保細(xì)胞狀態(tài),;

2)細(xì)胞培養(yǎng)到不同密度都能用于電轉(zhuǎn),,但好的轉(zhuǎn)化效率是在細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(15代以內(nèi),傳代后2d)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),,有絲分裂較旺盛,,表面結(jié)構(gòu)密度比穩(wěn)定期的細(xì)胞差,電轉(zhuǎn)后,,細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng),,而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA。

 

3.轉(zhuǎn)染底物狀態(tài)

1)不同的轉(zhuǎn)染底物對(duì)轉(zhuǎn)染效率都會(huì)產(chǎn)生不同的影響,,例如質(zhì)粒DNA在大小,、用量以及構(gòu)象這三方面都影響著電轉(zhuǎn)效率,IRES導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低,,轉(zhuǎn)染mRNA需要調(diào)整洗滌次數(shù)等等,;

2)轉(zhuǎn)染試劑與底物的配比,也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,,因此需要根據(jù)說(shuō)明書或參考文獻(xiàn)來(lái)進(jìn)行配比優(yōu)化實(shí)驗(yàn),,選用最佳配比濃度;

3)底物的內(nèi)毒素,,也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,,內(nèi)毒素含量過高,會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染過程中細(xì)胞狀態(tài)變差,,從而增加細(xì)胞死亡率,,降低轉(zhuǎn)染效率,因此要對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行控制,。

 

三,、如何提高電轉(zhuǎn)效率?

我們都知道,,電轉(zhuǎn)的操作是需要借助儀器來(lái)完成的,,因此除了要考慮上面的這些因素外,更重要的是選擇一個(gè)高效的電轉(zhuǎn)儀,。Nucleofector™技術(shù)是Lonza公司的zhuan利創(chuàng)新技術(shù),,利用電擊在細(xì)胞膜上開個(gè)小孔,綜合各種特定細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序與轉(zhuǎn)染液的作用,,核酸底物不僅可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),,還可直接通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核。相較于傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)技術(shù),,Nucleofector™技術(shù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率可達(dá)99%,,且實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染不依賴于細(xì)胞的分裂。

 

01 Nucleofector™技術(shù)核心:核電轉(zhuǎn)

利用特定的轉(zhuǎn)染試劑和細(xì)胞保護(hù)劑,,通過細(xì)微差別的電脈沖,,使得轉(zhuǎn)染物質(zhì)不僅可以直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),,而且可以直接通過核膜進(jìn)入到細(xì)胞核。

 

注:圖片來(lái)自Lonza

 

02 Nucleofector™技術(shù)組成

1)Nucleofector™設(shè)備:內(nèi)置針對(duì)每種細(xì)胞優(yōu)化好的轉(zhuǎn)染參數(shù),。

2)配套試劑盒:試劑盒是包含有轉(zhuǎn)染試劑,,細(xì)胞保護(hù)劑,專用電極杯,,吸管,、pmaxGFP™陽(yáng)性質(zhì)粒。

3)數(shù)據(jù)庫(kù)與操作手冊(cè):幾百種細(xì)胞的詳細(xì)的優(yōu)化方案,,不僅有轉(zhuǎn)染步驟,也包含了核轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的處理,,如細(xì)胞來(lái)源,、傳代、生長(zhǎng)條件,、培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)等細(xì)節(jié)技巧,。

 

03 提高電轉(zhuǎn)效率的方法

 

1.細(xì)胞收集時(shí):

1)在消化貼壁細(xì)胞時(shí),一定要注意終止胰酶反應(yīng),,防止過度消化,;最好使用專業(yè)的胰酶中和劑;

2)在進(jìn)行細(xì)胞離心時(shí),,使用低轉(zhuǎn)速長(zhǎng)時(shí)間離心,,提升細(xì)胞的存活率;

3)選擇合適狀態(tài)的細(xì)胞,,一般原代細(xì)胞可以傳1-2次后使用,;盡量挑選迭代次數(shù)少的細(xì)胞,如果是凍存細(xì)胞,,建議復(fù)蘇1-2h后使用,;

4)選擇對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞;

5)做好支原體清除,。

 

2.試劑添加:

1)電轉(zhuǎn)試劑的添加只需室溫操作即可,;

2)細(xì)胞在試劑中停留不超20min,混合好盡快開始實(shí)驗(yàn),;

3)轉(zhuǎn)染的底物占比不能大于總體積的10%,,比如轉(zhuǎn)染體系100ul,底物最多添加10ul,;

4)在消化的細(xì)胞進(jìn)行配置時(shí),,一定要離心并wan全去除殘留培養(yǎng)基;

5)在加入到電極杯中時(shí),,要避免產(chǎn)生氣泡,,從而影響電脈沖;

6)對(duì)底物進(jìn)行內(nèi)毒素控制;

7)轉(zhuǎn)染試劑與底物濃度配比控制,;

8)如果是mRNA轉(zhuǎn)染,,可多洗滌2次。

 

3.程序設(shè)置:

1)使用Lonza電轉(zhuǎn)儀,,程序已經(jīng)設(shè)定好,,可以根據(jù)不同的細(xì)胞名稱,選擇對(duì)應(yīng)的優(yōu)程序,; 根據(jù)實(shí)際情況,,可以對(duì)程序進(jìn)行微調(diào),確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率,。

2)使用需要自行設(shè)置的儀器,,一般電場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)置遵循低電場(chǎng)、長(zhǎng)時(shí)程的原則,。

 

4.細(xì)胞重懸:

1)轉(zhuǎn)染結(jié)束之后,,可以先停留10min再加培養(yǎng)基重懸;

2)使用無(wú)鈣培養(yǎng)基重懸,,5-10min后轉(zhuǎn)移細(xì)胞到培養(yǎng)皿上,;

3)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)一般在轉(zhuǎn)染后24h再進(jìn)行;

4)電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞,,鋪板數(shù)量翻一倍,。

 

5.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的培養(yǎng):選擇表達(dá)高峰期細(xì)胞做實(shí)驗(yàn),推薦文獻(xiàn)可在Lonza查詢,。

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