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警惕,!身體中的尼古丁,!血漿中可替寧和 3-羥基可替寧UHPLC-MSMS同時測定法

來源:深圳市諾亞迪化學(xué)科技有限公司   2023年08月24日 09:23  

吸煙和二手煙對身體傷害極大危害包括增加肺癌的發(fā)病率,、導(dǎo)致不孕或胎兒畸形,、容易骨質(zhì)疏松等。

2020年,,中國疾病預(yù)防控制中心,,對北京、上海,、深圳等六城市的餐飲場所工作人員進(jìn)行了大規(guī)模的研究調(diào)查,,經(jīng)檢測即使是已出臺全面無煙立法城市可替寧檢出率34.12%,,三羥基可替寧檢出率16.32%未出臺全面無煙立法城市,,相應(yīng)指標(biāo)更高,,可替寧檢出率68.04%,,三羥基可替寧檢出率41.94%

(數(shù)據(jù)來源:中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,,年,卷(期):2021,55(12)

如此高的檢出率煙草煙霧暴露,,成為一個不容忽視的重要社會問題。

尼古丁是煙草中含量最高的生物堿,,在人體內(nèi)半衰期較短,其70%~80%代謝產(chǎn)物為可替寧,。當(dāng)接觸煙草煙霧后,,在人體的不同生物樣本基質(zhì)中均可檢測出可替寧,。可替寧在人體中可進(jìn)一步代謝為3-羥基可替寧,,因此,,可替寧和3-羥基可替寧可作為煙草煙霧暴露的生物標(biāo)志物,。

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可替寧

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3-羥基可替寧

為了您和家人身體健康,,遠(yuǎn)離吸煙和二手煙。



血漿中可替寧和 3-羥基可替寧的測定

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納鷗科技助力尼古丁代謝產(chǎn)物在人體內(nèi)的檢測,本應(yīng)用在檢測血漿中可替寧和羥基可替寧的基礎(chǔ)上,,對樣本前處理流程、液相色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化,建立了檢測血漿中可替寧和羥基可替寧的檢測方法。

一,、摘要:

目的  建立血漿中可替寧和 3-羥基可替寧的固體介質(zhì)液液萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定法,。

方法  在血漿樣品中加入同位素內(nèi)標(biāo)和氫氧化鉀后,使用 96孔SLE液液萃取板凈化,凈化液經(jīng)異丙醇二氯甲烷溶液洗脫,、氮氣吹干,純水復(fù)溶,使用Anavo XP C18色譜柱(100 mmⅹ2.1 mm,1.7 µm),以 0.1%氨水溶液-乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫,使用多反應(yīng)監(jiān)測模式采集數(shù)據(jù),。

結(jié)果  可替寧和羥基可替寧在0.1~300 ng/ml線性范圍內(nèi)方法線性良好(r>0.999),可替寧方法定量下限為0.03 ng/ml,三羥基可替寧方法定量下限為0.02 ng/ml??商鎸幍募訕?biāo)回收率為95.0%~99.4%,RSD為2.1%~3.3%。三羥基可替寧的加標(biāo)回收率為95.8%~97.4%,,RSD為2.1%~4.2%,。結(jié)論  該方法取樣量少,、操作簡便、方法精密度高,適合大規(guī)模樣品的篩查檢測工作,。

二、測定原理

可替寧,、3-羥基可替寧通過同位素稀釋高效液相色譜質(zhì)譜方法測量,。向血漿(清)樣品中加入甲基-D3-可替寧、反式3-羥基可替寧-D3作為內(nèi)標(biāo),,樣品堿化然后加入到液體提取盤(SLE)中。分析物被混合的異丙醇和二氯甲烷提取,,濃縮,,剩余物復(fù)溶后進(jìn)樣到C18色譜柱上,洗脫液洗脫,,LC-MS測定,。

可替寧的母離子為m/z 177,子離子為m/z 80,,3-羥基可替寧的母離子為m/z 193,子離子為m/z 80,。內(nèi)標(biāo)和離子對配合各自的監(jiān)控化合物,。以標(biāo)準(zhǔn)系列峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比和可替寧,、3-羥基可替寧濃度,做工作曲線,。


三、實驗過程
1,、儀器與試劑


液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

Anavo 96孔板正壓固相萃取裝置(PN:AN25D021)

Anavo 96孔板氮吹儀(PN:AN25D020)

Anavo SLE+ 400mg 96孔板(PN: AN25H007)

Anavo 2m深孔96孔板收集盤(PN: AN25J017)

Anavo XP雜化硅膠UHPLC C18色譜柱(PN:AN80A006)

12通道300µL移液器

漩渦振蕩器

冰醋酸、醋酸銨,、氫氧化鉀:優(yōu)級純

異丙醇,、甲醇,、二氯甲烷:色譜純



2、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
可替寧:100µg/mL,、 3-羥基可替寧:100µg/mL, 甲基-D3-可替寧: 100µg/mL,、反式3-羥基可替寧-D3: 100µg/mL

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制    
準(zhǔn)確稱取適量的COT和HC標(biāo)準(zhǔn)溶液溶于純水,,得到0.10,、0.30,、0.50,、1.00、3.00,、5.00、10.00,、30.00,、50.00、100.00,、300.00 ng/ml的COT和HC標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,,含D3-COT和D3-HC內(nèi)標(biāo)濃度為20.0 ng/ml,。以COT,、HC定量離子峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積之比對COT,、HC標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

4,、樣品前處理
準(zhǔn)確吸取 200 μl樣本(高濃度樣本吸取50 μl血漿+純水150 μl),依次加入50 μL的0.2 mol/L 氫氧化鉀溶液,、50 μl的D3-COT 和 D3- HC 混合內(nèi)標(biāo)溶液到 96 孔混合盤中,使用排槍抽吸混勻,。將上述混合溶液全部轉(zhuǎn)移至SLE提取盤中,,放置5 min。加入0.3 ml 的5%異丙醇二氯甲烷混合液,,放置5 min后,,使用96孔正壓固相萃取裝置以3.5 psi氮氣壓20 s(該流程重復(fù)6次)。合并洗脫液于96孔板收集盤中,,放置于96孔氮吹儀上用氮氣吹干,吹干后加入100 μl純水復(fù)溶,,蓋上密封墊,,漩渦混勻后上機(jī)檢測。




5,、LC-MS-MS測定
1)HPLC的條件和參數(shù)
分析柱:Anavo XP C18, 1.7µm, 2.1*100mm(PN:AN80A006)
流動相:0.1%氨水-乙腈
梯度洗脫條件:見表1,。
進(jìn)樣量:5 μl
流速:300 μl/min
柱溫:40 ℃
表1 梯度洗脫條件(體積分?jǐn)?shù))


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2)質(zhì)譜條件


電噴霧離子源(ESI),;正離子掃描,噴霧電壓:4500 V,;離子源溫度:550 ℃,,碰撞氣壓力:中性碰撞氣;氣簾氣壓力:0.24 MPa,;霧化氣壓力(GS1)和輔助加熱器壓力(GS2):0.38 MPa。多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式采集,。其他質(zhì)譜參數(shù)見表2,。


表2 質(zhì)譜條件


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可替寧色譜圖
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3-羥基可替寧色譜圖



配套關(guān)鍵耗材

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