原代細胞(primary cell)：是指從機體的組織(如人組織,、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個細胞并在體外進行模擬機體培養(yǎng)的細胞,，稱為原代細胞,。一般認為，培養(yǎng)的原代的第1代細胞和傳代到第10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng),。

原代細胞的獲取難度大,、需要考慮的問題多，原代細胞如何獲??？

原代細胞的獲取，就是從活體上將組織分解成單個細胞再進行培養(yǎng)的過程,，且整個過程要求無菌操作,。具體要考慮的問題有：組織分解的方式，培養(yǎng)的時間,，換液時間,，細胞狀態(tài)判斷和凍存。

一,、組織分解的方式

將組織分解成單個細胞的方式目前主要有兩種：酶消化法和組織塊法（針對貼壁細胞）,。

1. 酶消化法：所用試劑：膠原酶和胰酶,。

 膠原酶的選擇：（根據(jù)自己的組織樣本選擇合適的膠原酶是實驗成功的大前提。）

膠原酶的配制：常用的是DMEM進行配制，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）,。

膠原酶消化時間：根據(jù)組織特性,，消化時間會有差異。以小鼠腎細胞為例,，加入膠原酶Ⅰ進行消化后,，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右，期間每隔10min中震蕩一次,，知道組織塊幾乎wan全消失為止（若是組織塊剪得非常細小,，時間可以短一些，30min左右即可）,。

培養(yǎng)過程：注意原代細胞在培養(yǎng)2天后可能會出現(xiàn)細胞液變黃（橘黃色）的現(xiàn)象,，且無漂浮物，這是正?，F(xiàn)象哦,，不是污染。這是由于細胞在貼壁生長過程中釋放了CO2和其他物質(zhì)導致培養(yǎng)液PH發(fā)生了改變,，所以變黃,。

2. 組織塊法

取材：取組織中間部位，剪成大小均勻的小方塊（1~4mm²）,，清洗干凈后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中,，在培養(yǎng)皿中各組織塊要排列均勻。 

加液：培養(yǎng)液不能浸沒組織塊,，避免組織漂浮,。然后培養(yǎng)4h左右加培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后換液,。

二,、培養(yǎng)時間

無論是酶消化法還是組織塊法,，取樣后培養(yǎng)時間最少需要一周以上的時間，期間可換液或者傳代,。

三,、換液時間

無論酶消化法還是組織塊法，在培養(yǎng)期間需要隨時關(guān)注細胞的生長狀況,，需觀察其是否貼壁,，是否污染，組織塊法要觀察是否有細胞遷移出來,。正常情況下48~72h可換液一次,。

四、細胞狀態(tài)判斷

正常貼壁細胞在培養(yǎng)幾天后,，會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底,，有的呈纖維狀,，有的呈多邊形,。這些細胞的狀態(tài)比較好，生長至80%~90%融合就可以傳代啦,，傳代一次后的細胞會更干凈漂亮,。

五、凍存

傳一代后的細胞（也可以不傳代直接凍存）培養(yǎng)至80%~90%便可凍存起來供后續(xù)實驗用,。

凍存液配制：不同的細胞可能會有不同的凍存液配制方案,，各實驗室也有自己的凍存方案，

常見的方案有：

a: 10%DMSO+90%的FBS,；

b: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM,；

c: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS 。

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