1.PCR技術(shù)基本原理
PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,,使之成為單鏈,,以便它與引物結(jié)合,,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,,溫度降至55℃左右,,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,,以dNTP為反應(yīng)原料,,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,,2~3小時就能將待擴目的基蚶┰齜糯蠹赴僂蟣丁5醬鍥教ㄆ?Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。
PCR的反應(yīng)動力學(xué) PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行,,使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴增量可用Y=(1+X)n計算,。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù),,X表示平(Y)均每次的擴增效率,n代表循環(huán)次數(shù),。平均擴增效率的理論值為100%,,但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期,,靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式,,隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加,,而進入線性增長期或靜止期,,即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,這種效應(yīng)稱平臺期數(shù),、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下,平臺期的到來是不可避免的,。
PCR擴增產(chǎn)物 可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分,。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5’端之間,是需要擴增的特定片段,。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的,,以一個原始模板為例,在第一個反應(yīng)周期中,以兩條互補的DNA為模板,,引物是從3’端開始延伸,,其5’端是固定的,3’端則沒有固定的止點,,長短不一,,這就是“長產(chǎn)物片段”。進入第二周期后,,引物除與原始模板結(jié)合外,,還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時,,由于新鏈模板的5’端序列是固定的,,這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點,保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi),、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”,。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加,而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加,,幾乎可以忽略不計,, 這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化,就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用,。
2.PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系:
10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.1~2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul
PCR反應(yīng)五要素: 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶、dNTP,、模板和Mg2+
引物: 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,,只要知道任何一段模板DNA序列,,就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增,。
設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則:
?、僖镩L度: 15-30bp,常用為20bp左右,。
?、谝飻U增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段,。
?、垡飰A基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
?、鼙苊庖飪?nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補,,特別是3’端的互補,,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶,。
?、菀?’端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點,,被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
?、咭锏奶禺愋裕阂飸?yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
相關(guān)產(chǎn)品
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