激光共聚焦顯微鏡可以觀察到細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)標(biāo)記好的蛋白質(zhì)和分子，為生物學(xué)研究提供了更直觀的觀測方法,。那在細(xì)胞實驗中,，如果要進(jìn)行一次激光共聚焦成像,，都有哪些操作方法可實驗應(yīng)用。

　　傳統(tǒng)實驗操作方法：

　　由于激光共聚焦實驗對觀測耗材的底部有著比較高的要求,，普通的培養(yǎng)皿,，培養(yǎng)板或者培養(yǎng)瓶都不能直接用于激光共聚焦成像。

　　1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細(xì)胞載體,。但是使用蓋玻片,，如果買的是國產(chǎn)的蓋玻片，需要先做的一步是將蓋玻片清洗并且烘干滅菌,，才能開始使用,。

　　2.進(jìn)口的細(xì)胞爬片，雖然不需要清洗,，但是還是需要進(jìn)行包被才能讓細(xì)胞正常貼壁生長,。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中，然后鋪細(xì)胞,，熒光染色后,，再用鑷子將爬片拿出，反過來放在滴有封片劑（甘油配置）的載玻片上,，再進(jìn)行成像,。如圖1所示：　　

圖1：使用蓋玻片和細(xì)胞爬片的做免疫熒光方法示意圖

　　實驗操作流程：

　　1.蓋玻片需用濃硫酸浸泡過夜,，第二天用自來水沖洗20遍,，置于無水乙醇中6小時，后用三蒸水沖洗3遍,，再放在飯盒或玻璃培養(yǎng)皿中烘干,，消毒，再烘干后放入超凈臺備用,。

　　2.準(zhǔn)備好的蓋玻片或者專業(yè)的細(xì)胞爬片需要根據(jù)細(xì)胞的貼壁情況使用多聚賴氨酸等蛋白包被,。

　　3.培養(yǎng)板中放置爬片非常有技巧，要將爬片與培養(yǎng)板底部緊密貼合,，這樣才能避免長成雙層細(xì)胞,。

　　4.常規(guī)免疫熒光操作后，取出爬片,。準(zhǔn)備載玻片一張,，在中間滴加適量的封片劑（甘油配置），將蓋玻片或爬片翻過來,，蓋在封片劑上,，再用指甲油封片進(jìn)行成像。

　　5.在激光共聚焦成像之前,，盡量用熒光顯微鏡檢查一下細(xì)胞狀態(tài)和成像效果,，再去做激光共聚焦,，畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的。

　　ibidi無需爬片的簡便方法：

　　ibidi實驗應(yīng)用,，大大簡化了樣品準(zhǔn)備流程,，但需要用到專為共聚焦實驗設(shè)計的共聚焦培養(yǎng)皿，例如ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿ibidi 81156,，ibiTreat底部處理,。

　　這款共聚焦培養(yǎng)皿的底部是polymer聚合物材質(zhì)，具有親水表面,，可讓大多數(shù)種類的細(xì)胞都可以直接貼壁,，無需另外進(jìn)行包被；同時,，它們的底部符合蓋玻片標(biāo)準(zhǔn)——厚度僅為180μm,，在折射率，阿貝系數(shù)上,，它們的性能和標(biāo)準(zhǔn)爬片一致,，再加上極低的自發(fā)熒光和細(xì)胞可以直接貼壁的特性，使它們成為共聚焦成像的專用培養(yǎng)皿,。所有的操作都在培養(yǎng)皿中進(jìn)行,，不再需要鑷子以及繁瑣的清洗，滅菌,，包被程序（流程如圖2所示）

圖2：共聚焦專用培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備樣品流程,，可以直接進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)－染色－成像操作（圖中使用的產(chǎn)品為ibidi 81156共聚焦培養(yǎng)皿）

　　實驗操作流程：

　　1.在超凈臺中打開無菌包裝的共聚焦專用培養(yǎng)皿，取出培養(yǎng)皿,，加入細(xì)胞懸液,，蓋上皿蓋，放入培養(yǎng)箱中靜置,，等待細(xì)胞貼壁,。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長置合適密度再取出,，進(jìn)行免疫熒光染色,。

　　2.吸出培養(yǎng)基，以PBS清洗細(xì)胞,，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細(xì)胞,。

　　3.20分鐘后，吸出固定液,，加入0.1%Triton X-100

　　4.10分鐘后,，吸出Triton，清洗細(xì)胞后加入BSA封閉,。

　　5.加入抗體熒光染色后,，吸出所有試劑,，加入封片劑，可以開始共聚焦顯微成像,。

　　使用共聚焦培養(yǎng)皿還有個好處：往往一個共聚焦掃描成像持續(xù)時間很長,，培養(yǎng)皿中的液體非常容易揮發(fā)，共聚焦培養(yǎng)皿有皿蓋,，可以減少揮發(fā),；如上述提到的ibidi共聚焦培養(yǎng)皿，有個巧妙的鎖扣設(shè)計,，可以扣緊培養(yǎng)皿,，確保在共聚焦成像的過程中，皿中的液體不會揮發(fā)(如圖3）,?！　?/span>

圖3：ibidi共聚焦培養(yǎng)皿的鎖扣設(shè)計　

　　ibidi共聚焦皿方法的應(yīng)用優(yōu)勢。一個培養(yǎng)皿完成細(xì)胞培養(yǎng)－染色－成像等系列操作,，無需包被,，無需爬片，操作簡便,；在培養(yǎng)皿里的操作對于操作技術(shù)的要求相對更低,，也更便捷；培養(yǎng)皿可使用皿蓋減少蒸發(fā),，杜絕揮發(fā)對成像的影響,。

　　ibidi培養(yǎng)皿信息：