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ELISA測(cè)定現(xiàn)在通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測(cè)定模式,，測(cè)定操作非常簡(jiǎn)單,，一般涉及到標(biāo)本的收集保存,、試劑準(zhǔn)備、加樣,、溫育,、洗板,、顯色,、比色,、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果,，且尤以加樣,、溫育和洗板等步驟為甚。現(xiàn)分述如下,。
一,、臨床標(biāo)本的收集和保存
用于ELISA測(cè)定的臨床標(biāo)本最為常用的是血清(漿)，有時(shí)因?yàn)樘囟ǖ臋z測(cè)目的,，也用到唾液,、腦脊液、尿液,、糞便等標(biāo)本,。目前臨床上使用血清標(biāo)本測(cè)定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體,、腫瘤標(biāo)志物、激素,、特種蛋白,、細(xì)胞因子和治療藥物等,。對(duì)用于激素和治療藥物測(cè)定的血清標(biāo)本的收集,，要注意收集時(shí)間甚或體位有可能會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨4～6點(diǎn)之間,，會(huì)有一峰值出現(xiàn)：生長(zhǎng)激素,、促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以陣發(fā)性方式釋放，因此,，在測(cè)定此類(lèi)激素時(shí),，有必要在密切相連的時(shí)間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測(cè)定值,。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r(shí),，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測(cè),，應(yīng)根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)選擇服藥后的最適時(shí)間抽血檢測(cè),。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測(cè)的血清標(biāo)本的收集則沒(méi)有時(shí)間和體位方面的影響,，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：
（1）要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血,。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類(lèi)似過(guò)氧化物的活性,，因此,，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高,，則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相,，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。
（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染,，一則細(xì)菌的生長(zhǎng),，其所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾,。
（3）血清標(biāo)本如是以無(wú)菌操作分離,，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作,，則建議冰凍保存,。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在-70℃以下,。
（4）冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融,。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,，從而引起假陰性結(jié)果。此外,，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意,，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可,。
（5）標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí),，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。
二,、試劑準(zhǔn)備
在臨床實(shí)驗(yàn)室,，對(duì)試劑準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是,，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來(lái)即用,，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問(wèn)題，其直接的后果是對(duì)一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性,。因此在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是,，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái),，在室溫下放置20分鐘以上后,，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡,。這樣做的目的,，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度,，以滿足測(cè)定要求,。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)對(duì)所提供的濃縮液稀釋配制,，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量,。此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時(shí),，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前臨時(shí)配制,。
三、加血清樣本及反應(yīng)試劑樣本
在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中,，血清樣本的加入幾乎是要使用微量加樣器加入樣本的步驟,。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部,，不可濺出和產(chǎn)生氣泡,。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性,。加在孔壁上部的非包被區(qū),，易導(dǎo)致非特異吸附,。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異,。試劑的加入在國(guó)產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加,，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要,，滴加太快,，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會(huì)在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附,，從而引起非特異顯色,。所以,，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性,，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致,。
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