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探索活細(xì)胞脂肪代謝過程:光學(xué)紅外顯微成像技術(shù)揭開DNL的奧秘

來源:QUANTUM量子科學(xué)儀器貿(mào)易(北京)有限公司   2023年07月11日 16:23  

從頭脂肪生成(DNL)是脂肪和肝臟組織產(chǎn)生脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵過程,。該途徑的失調(diào)與肥胖、非酒精性脂肪性肝病和II型糖尿病密切相關(guān),。但是DNL在細(xì)胞內(nèi)的研究非常困難,常規(guī)的脂質(zhì)染料缺乏特異性,,抗體和小分子染料很難特異性標(biāo)記這些脂質(zhì)體,。雖然目前可以使用葡萄糖基代謝探針等同位素來標(biāo)記這些物質(zhì),但是很難具備亞微米級別的空間分辨率,,同時(shí)無法對細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行成像,,也不能提供脂質(zhì)的特性和其他環(huán)境生物分子的組成信息。這些都極大的限制了脂質(zhì)體的相關(guān)研究,,尤其是活細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的研究,。


美國PSC公司研發(fā)的全新非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)——mIRage的出現(xiàn)為上述問題提供了新的解決方案。mIRage采用新型光學(xué)光熱誘導(dǎo)共振(O-PTIR)技術(shù),,不僅具備傳統(tǒng)FTIR的特性,,可以對物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,還克服了傳統(tǒng)紅外空間分辨率不足,,無法精細(xì)表征細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的問題,,其分辨高達(dá)500 nm,可在亞微米尺度上實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀測,,與光學(xué)顯微鏡基本相同,,有助于理解亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。設(shè)備光熱膨脹技術(shù)能夠在不接觸樣品的情況下進(jìn)行檢測,,大幅度簡化了樣品制備過程,,全程對樣品無污染,并且沒有米氏散射問題,,可在不平整的表面上取得良好的譜線,。而其探測機(jī)制使得mIRage能夠很大限度上避免水的干擾,真正實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的探測,。


                                                                                 


近期,,耶魯大學(xué)成功安裝了非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)——mIRage,,并在活細(xì)胞脂肪代謝研究中取得了新的進(jìn)展!




在該研究中,,Sydney O. Shuster等人使用非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)——mIRage觀測DNL在活細(xì)胞和固定脂肪細(xì)胞中的分布,。作者認(rèn)為在DNL、葡萄糖或其他碳水化合物代謝形成游離脂肪酸(FFA) 和甘油三酯的途徑中,,首先形成糖酵解丙酮酸,,后被帶進(jìn)線粒體,通過TCA循環(huán)轉(zhuǎn)化為檸檬酸鹽,。檸檬酸鹽再轉(zhuǎn)化為?;o酶a和丙二酰輔酶a用于脂肪酸合成并產(chǎn)生甘油三酯,然后儲(chǔ)存在脂滴中作為能量儲(chǔ)備,。通過mIRage對固定的3T3-L1細(xì)胞的成像分析,,作者通過脂肪代表性的酯羰基振動(dòng)1747cm-1成功定位到細(xì)胞中的大部分脂質(zhì)、甘油三酯的分布,,并通過1655和1541cm-1處的酰胺-I和酰胺-II帶定位蛋白質(zhì),。



DNL的代謝途徑與固定細(xì)胞的明場與紅外脂質(zhì)體與蛋白的熱圖成像


為了跟蹤葡萄糖代謝和DNL,作者給細(xì)胞喂入13C葡萄糖來代替12C葡萄糖,。因?yàn)樗姆肿诱駝?dòng)模式與所涉及的原子質(zhì)量增加導(dǎo)致紅外波數(shù)的紅移,通過檢測發(fā)現(xiàn)羰基的拉伸震動(dòng)紅移了44 cm-1,。有趣的是1239 cm-1的波段本身不能明確地區(qū)分給C-O-C或PO2 ,,而未標(biāo)記細(xì)胞中的不對稱拉伸在13C標(biāo)記后時(shí)消失,這可能是紅移到相鄰的峰中導(dǎo)致的,。這表明該峰值的主要來源是C-O-C 甘油三酯和/或膽固醇酯的不對稱拉伸震動(dòng),,并且磷脂不會(huì)顯著地干擾3T3-L1脂肪細(xì)胞中的信號(hào)。而蛋白信號(hào)在這一過程中沒有變化,,表明蛋白質(zhì)不會(huì)隨著13C葡萄糖的供給而偏移,。與之相對,CH3和CH2相關(guān)的1450cm-1波段蛋白質(zhì)和脂類的變形和伸展震動(dòng)的出峰不變,。這可能是由于形成的甘油三酯來自游離脂肪酸和甘油的酯化,。雖然兩者都是 FFA和甘油由葡萄糖通過糖酵解產(chǎn)生,但它們以不同的速度產(chǎn)生和回收,,影響著這些波段的移動(dòng)速率,。


進(jìn)一步對加入13C葡萄糖24、48和72小時(shí)后的細(xì)胞進(jìn)行檢測,,結(jié)果顯示平均單細(xì)胞13C/12C比率在測試期間(72小時(shí))持續(xù)增加,,最終比率為0.54±0.14。其中大部分的13C轉(zhuǎn)化成甘油三酯,,并且DNL在空間上也是異質(zhì)的,。



對不同時(shí)間點(diǎn)固定的細(xì)胞進(jìn)行觀測和對比其中的DNL含量


在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,,也取得了和固定細(xì)胞類似的結(jié)果,并且活細(xì)胞的光譜圖像比固定的更清晰,,細(xì)胞和與蛋白質(zhì)酰胺-I信號(hào)重疊較少證明了這項(xiàng)技術(shù)甚至可以檢測到活細(xì)胞中甘油三酯到12C甘油三酯13C比率的微小差異,。



活細(xì)胞的DNL含量觀測


綜上所述,非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)——mIRage在細(xì)胞成像中具有優(yōu)異的潛力,,可以提供脂質(zhì)種類的信息,,提供對低濃度物質(zhì)如游離脂肪酸的定位,并允許對每個(gè)樣品的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)光譜特征進(jìn)行全面位置光譜分析,,并且能夠應(yīng)用長時(shí)間觀測,。這項(xiàng)技術(shù)未來將可以用于繪制細(xì)胞系和細(xì)胞內(nèi)DNL的比率、疾病狀態(tài),,進(jìn)一步揭示DNL 導(dǎo)致代謝紊亂的原因,。在評估針對調(diào)節(jié)DNL和治療疾病的藥物方面提供諸多幫助。


參考文獻(xiàn):

Spatiotemporal Heterogeneity of De Novo Lipogenesis in Fixed and Living Single Cells. J. Phys. Chem. B 2023, 127, 2918?2926




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