ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定,。但ELISA測(cè)定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求,，在檢測(cè)過(guò)程中除正常反應(yīng)外,，有時(shí)常見(jiàn)到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：①標(biāo)本因素,；②試劑因素,；③操作因素。下面就一些常見(jiàn)ELISA操作過(guò)程中的問(wèn)題一一分析,。
1．樣品稀釋
酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng),，如果血清不稀釋，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng),，出現(xiàn)假陽(yáng)性,。因此，國(guó)外檢測(cè)血清抗體的試劑盒,，均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù),，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來(lái),。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過(guò)大量試驗(yàn)確定,，以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。但是,，有些用戶未能嚴(yán)格按使用說(shuō)明書(shū)操作,，如某些產(chǎn)品應(yīng)取10μl樣品進(jìn)行稀釋，個(gè)別用戶取5μl甚至1μl樣品進(jìn)行稀釋,，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠,，因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)問(wèn)題,。
2．試劑盒平衡
試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫（約25℃）,，一般需在室溫放置20～30分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠,，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短,，ELISA反應(yīng)不夠充分,。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘,。
3．樣品和試劑的混勻
稀釋前,、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻,，以保證試驗(yàn)的均一性,。
4．加樣
在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟,。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快,，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡,。加樣太快,，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū),，易導(dǎo)致非特異吸附,。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異,。所以,，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性，下次測(cè)定為陰性,，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致,。
5．溫育
溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定,，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合,，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間,。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高,，則所需時(shí)間相對(duì)較短,。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃,。一些操作者,，擅自改變說(shuō)明書(shū)操作，使用自己喜歡的溫育時(shí)間和溫育溫度,，這樣造成一些不必要的麻煩,。因?yàn)椋煌噭┖杏胁煌臏赜龝r(shí)間和溫育溫度的選擇,，隨意更改溫育時(shí)間或者溫育溫度將導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差,。
6．洗板
固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù),，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái)，以保證ELISA測(cè)定的特異性,。洗板對(duì)于ELISA測(cè)定來(lái)說(shuō),，也是極其關(guān)鍵的一步。洗液盡量不要溢出孔外,；加洗液后要靜置1分鐘,，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干,；及時(shí)更換吸水紙,，尤其是拍過(guò)酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果,。
7．邊緣效應(yīng)
使用96孔板的ELISA測(cè)定中,，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深,。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所,。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中,，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱,，板也升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度,。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí),，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”,，并且可提高測(cè)定的重復(fù)性,。
8．顯色
顯色一定要控制時(shí)間,根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作即可。一般來(lái)說(shuō),，顯色時(shí)間過(guò)短,，結(jié)果偏低；顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，空白增高或者非特異性顯色增加,。
9．比色
比色要注意波長(zhǎng)的選擇。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用,，而前者比色波長(zhǎng)為450nm,，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換,。因此,，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題。
其次，單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問(wèn)題,。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有zui大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定,；而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋,、刮痕,、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值,，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零,，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。zui后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非常感波長(zhǎng)下的吸光度值的差,。因此,，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收,、指紋,、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn),。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性,，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí),，是使用雙波長(zhǎng)比色,。

綜上所述，盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常簡(jiǎn)單,，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多,，分布在測(cè)定操作的各步之中，尤以加樣,、溫育和洗板為甚,。