細(xì)胞內(nèi)的鈣稱為細(xì)胞內(nèi)鈣，可受到高度調(diào)節(jié),；這種緊密的調(diào)節(jié)使細(xì)胞內(nèi)鈣成為了解細(xì)胞功能和信號動力學(xué)的較佳的工具,，使其能夠在細(xì)胞遷移、交流和對刺激物或異物作出反應(yīng)的能力,。

　　鈣：細(xì)胞過程的多功能指示劑

　　鈣信號可作為讀數(shù)來了解病毒在感染過程中利用宿主信號反應(yīng)的能力,，并剖析所涉及的信號通路。有幾種細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光指示劑是可用于研究細(xì)胞功能,；能夠檢查傷口愈合,、傳染病、藥物治療等過程中的細(xì)胞反應(yīng),。為此可利用含有熒光鈣指示劑的細(xì)胞的活細(xì)胞成像,，其中熒光的增加表明細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。

　　鈣指示劑的種類及其應(yīng)用

　　鈣指示劑主要分為兩大類：化學(xué)指示劑和基因編碼的鈣指示劑,?？捎糜诨罴?xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的鈣指示劑類型取決于預(yù)期的細(xì)胞系、成像長度以及定性或定量數(shù)據(jù)的預(yù)期結(jié)果等因素,。

　　1.預(yù)期細(xì)胞系：

　　對于原代細(xì)胞系直接的方法是使用熒光染料,，將熒光鈣指示劑簡單地添加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，并在孵育期后成像,。

　　與基因編碼的鈣指示劑相比,，熒光染料通常更亮、更穩(wěn)定,。在活細(xì)胞成像中,，熒光染料可以有效地進(jìn)行短期活細(xì)胞成像，但隨著時間的推移細(xì)胞有排出染料的趨勢。鈣染料的一個重要考慮因素是使用抑制劑還是激動劑,。抑制劑和激動劑也可能影響鈣染料反映,，類似于在天然組織中的表達(dá)。

　　在廣泛的鈣信號傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,，已建立的細(xì)胞系是可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)遺傳編碼的鈣指示劑,，如GCaMP、黃色cameleon等,。對現(xiàn)有的不同基因編碼鈣指示劑進(jìn)行改進(jìn),，使指示劑更亮，光穩(wěn)定性更好,，動態(tài)范圍更大,，從而提高了鈣的敏感性。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞系中使用的一種較佳的工具,，它將允許您選擇的指示劑在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)?；蚓幋a報(bào)告系統(tǒng)的一個潛在問題是,，并非所有細(xì)胞系都容易被轉(zhuǎn)導(dǎo)?！　?/span>

　　在用ADP 進(jìn)行激動劑治療期間,，人腸道類器官單層的實(shí)時、短期成像,。這些有機(jī)體單層以綠色表達(dá)鈣指示劑 GCaMP6s,。ADP 是一種已知的激動劑，用于在細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣信號傳導(dǎo),。激動劑治療是測試治療劑量反應(yīng)的較的好方法,。

　　2.成像長度

　　對于活細(xì)胞成像，時間長度和間隔是需要記住的重要參數(shù),。細(xì)胞成像過程中的主要關(guān)注的是光漂白和光毒性,。應(yīng)避免持續(xù)使用激發(fā)光，重要的是選擇足夠強(qiáng)的曝光時間和光功率,，以檢測鈣信號,，但不要過強(qiáng)，以免對細(xì)胞造成損害,。成像的長度將取決于實(shí)驗(yàn),。對于測試激動劑或細(xì)胞反應(yīng)，這通常是5-20分鐘的較短成像運(yùn)行,，每1-2秒捕獲一次圖像,。對于研究傷口修復(fù)或病毒感染期間鈣信號傳導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)，我們會在18-20小時內(nèi)成像，每分鐘捕捉一次圖像,?！　?/span>

　　活細(xì)胞成像的技巧

　　考慮要使用的細(xì)胞系是很重要的。為了研究鈣動力學(xué),，使用形成單層的細(xì)胞系將確保感興趣的區(qū)域保持聚焦,，以捕捉信號動力學(xué)，從而獲得較佳質(zhì)量的視頻和清晰的量化,。對于涉及細(xì)胞間通訊和鈣動力學(xué)的實(shí)驗(yàn),，細(xì)胞系融合也是一個重要的考慮因素。為了獲得質(zhì)量的圖像,，選擇合適的載玻片非常重要,。有些細(xì)胞培養(yǎng)物更喜歡玻璃載玻片而不是光學(xué)級塑料載玻片，因此最好測試腔室載玻片,。我們的細(xì)胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室載玻片,。　　

μ-Slide 8 Well high（貨號： 80806）

　　活細(xì)胞成像是使細(xì)胞的密度允許形成一個融合的單層,，但不會導(dǎo)致細(xì)胞過度擁擠和團(tuán)塊,。在成像過程中需要使用合適的培養(yǎng)基。許多傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)基含有酚紅,，它可引起高背景熒光,。這使得在成像過程中很難從背景噪聲中分離出真實(shí)信號。因此,，重要的是用PBS洗滌細(xì)胞,，并用無酚紅培養(yǎng)基或市售的用于活細(xì)胞成像的培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基?！　?/span>