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原代培養(yǎng)

6,、類器官操作流程——觀察

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傳代培養(yǎng)

一,、類器官傳代培養(yǎng)——樣本收集

1、移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加 1-2ml左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G放置 2min,。

2、移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠,，收集在 15ml 離心管中,，4℃靜置 10min（每 6-8 孔為一組） 。

二,、類器官傳代培養(yǎng)——樣本消化

1,、類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml 離心管，300g4℃ 離心 5min（如圖5）棄去液體進(jìn)行第3步,。

2,、類器官數(shù)量較多或體積較大時(shí)：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加適量類器官傳代消化液 D（是類器官懸液的1-2倍）超凈臺(tái)內(nèi)消化 2-3min（中間可以吹打1-2次）（如圖6） ,，添加適量類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G（緩沖液G：傳代消化液D=5:1）終止消化,，300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml（ 如圖7） 離心管,，300g 4℃ 離心 5min 棄去液體進(jìn)行第3步,。（如圖4）

三,、類器官傳代培養(yǎng)——鋪板

類器官收集后,，添加25倍基質(zhì)膠重懸（基質(zhì)膠體積：細(xì)胞沉淀體積=25:1），每孔25μl（如圖8） 基質(zhì)膠鋪在 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 添加 500μl-750ul（如圖9）人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A,。

四、類器官傳代后增殖現(xiàn)象

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類器官凍存

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類器官復(fù)蘇

1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1）將水浴鍋預(yù)熱至37℃,；

2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒,，用預(yù)防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面,；

3）在超凈工作臺(tái)中按次序擺好消過毒的離心管、吸管,、培養(yǎng)板等,。

2、取出凍存管

1）根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào),。

2）從液氮罐中取出凍存盒,，取出所需的凍存管，同時(shí)核對(duì)凍存管外的編號(hào),。

3,、迅速解凍

迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動(dòng),，使管中的液體迅速融化,。約1-2min后凍存管內(nèi)液體溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁,，再拿入超凈臺(tái)內(nèi),。

4、將類器官組織液移入15ml離心管,，添加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 10ml重懸,，輕柔吹打混勻，300g 4℃ 離心 5min,。

5,、棄上清，添加1ml 類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸將沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管,，300g 4℃ 離心 5min,，棄去上清。

6,、添加25倍基質(zhì)膠（abs9495）重懸（基質(zhì)膠體積：細(xì)胞沉淀體積=25:1）,，每孔25μl基質(zhì)膠鋪在 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 添加 500μl-750ul 人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A,。

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類器官鑒定

一,、類器官鑒定——類器官收集

1、類器官收集,；

2,、清洗1-3遍，洗去大部分基質(zhì)膠,，離心棄去大部分上清,。

二、類器官鑒定——瓊脂糖凹槽制備

三、類器官鑒定——固定

四,、類器官鑒定——包埋

五,、類器官鑒定——HE染色

六、類器官鑒定——HE染色結(jié)果（以肺癌為例）

今天講解就到這了,，大家如有類器官問題,，歡迎公眾號(hào)“愛必信生物”留言交流哦！

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