一,、ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi),。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上,。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例,。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析,。由于酶的催化效率很高,，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度,。

二,、ELISA的類(lèi)型

ELISA可用于測(cè)定抗原,，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體,，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體,，稱(chēng)為"結(jié)合物"（conjugate）,；（3）酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件,，可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法,。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類(lèi)型：

①.雙抗體夾心法測(cè)抗原

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原常用的方法，操作步驟如下：

1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗體,。除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2）加待檢樣本,，孵育反應(yīng)。樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合,，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

3）加酶標(biāo)抗體,，孵育反應(yīng),。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。可以洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關(guān),。

4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。通過(guò)比色,，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。

②.雙抗原夾心法測(cè)抗體

反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類(lèi)似,。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體,。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體,。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定,，因此其敏感度相對(duì)高于間接法,。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,，尋找合適的標(biāo)記方法。

③.間接法測(cè)抗體

間接法是檢測(cè)抗體常用的方法,。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,，故稱(chēng)為間接法,。操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì),。

2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng),。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,，固相載體上只留下特異性抗體,，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。

3）加酶標(biāo)抗抗體,?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體,。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合,，從而間接地標(biāo)記上酶,。洗滌后,，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān),。

4）加底物顯色。本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷,。

④.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí),，可用此法檢測(cè)特異性抗體,。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多,，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少,，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的,，可直接包被固相,。如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功,，可采用捕獲包被法,，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原,，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì),，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng),。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,，抗HBc ELISA一般采用此法,。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體,，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng),。抗HBe的檢測(cè)一般采用此方法,。

⑤.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn),，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式,。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合,。標(biāo)本中抗原量含量愈多,，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,，最后的顯色也愈淺。小分子激素,、藥物等ELISA測(cè)定多用此法,。

⑥.捕獲包被法測(cè)抗體

IgM抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體,。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體,，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上,。因此如用抗人IgM作為二抗,，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理,，以除去IgG的干擾,。在臨床檢驗(yàn)中測(cè)定抗體IgM時(shí)多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相,，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）,。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合,。繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體。再與底物作用,，呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷,。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測(cè)模式,。類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測(cè)定IgM抗體，導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng),。因此中和IgG的間接法近來(lái)頗受青睞,，用這類(lèi)試劑檢測(cè)抗CMV IgM和抗弓形蟲(chóng)IgM抗體已獲成功。

⑦.ABS-ELISA法

ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語(yǔ),。親和素是一種糖蛋白,，分子量60000,，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成,。生物素為小分子化合物,，分子量244,。用化學(xué)方法制成的衍生物素- 羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類(lèi)型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物,，標(biāo)記方法頗為簡(jiǎn)便,。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多,，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定,。由于一個(gè)親和素可與 4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類(lèi)型,。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）,。在LAB 中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng),，然后再加酶標(biāo)記的生物素以進(jìn)一步提高敏感度,。在早期，親和素從蛋清中提取,，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng),，用于ELISA中可使本底增高,。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無(wú)此缺點(diǎn)，在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢(shì),。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑,，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多,。

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