微量分光光度計原理及應用

   微量分光光度計能夠快速準確的定量檢測核酸,、蛋白質等溶液,。具有使用方便,、消耗樣品少(僅2μl),、不用預熱、能迅速清理殘留樣品,、不需要比色皿或其它樣品定位裝置,、樣品不需要稀釋等特點，常用于核酸,，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量,，目前已成為眾多實驗室的常規(guī)儀器。

  工作原理

  超微量分光光度計進行濃度測定的原理是根據朗伯-比爾（Lamber-Beer）定律,，

A＝K·C·L

   式中,，A為吸光度；K為吸（消）光系數,；C為溶液的濃度,；L為液層厚度。此公式說明：在入射光一定時,，溶液的吸光度與溶液的濃度及液層厚度成正比,。此式就是光的吸收定律的數學表達式，又叫朗伯-比爾定律,。

  核酸定量

  核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能,。可以定量測定溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA以及RNA含量,。這是由于核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵,，具有紫外吸收的特性,，最大的吸收波長在260nm，吸收波谷在230nm,。

  除了核酸濃度,，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值,，用于評估樣品的純度,，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物，多肽,，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。

  蛋白質直接定量

  這種方法是在280nm波長,，直接測試蛋白,。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈,、成分相對單一的蛋白質,。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快,，操作簡單,；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾,；另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高。

  比色法蛋白質定量

  蛋白質通常是多種蛋白質的化合物,，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸,，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質,。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關,，從而反應蛋白質濃度,。