ELISA實驗操作要點：固體樣本處理方法

固體樣本處理方法：
        固體樣本處理原則：稱取1g的固體樣本，用9g的合適緩沖液溶解,，分泌蛋白可以直接離心取上清檢測,，細胞內(nèi)的蛋白,，要先收集細胞,，再用合適方法破碎，離心取上清測試,。

1,、組織標本：切割標本后，稱取1g組織,，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細收集上清,。分裝一份待檢測，其余冷凍備用,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。對于植物組織,，不好勻漿的話,，就用液氮研磨，將植物組織放在研缽中,，加入適量液氮,，充分研磨。
2,、細胞內(nèi)蛋白樣本：
許多待測蛋白不是分泌蛋白,，而是存在于細胞內(nèi)的蛋白，這個時候,，要先收集細胞,，洗滌干凈，再破碎細胞,，離心取上清,。
（1）培養(yǎng)的細胞
A、動物細胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液,，使細胞濃度達到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融（如果反復(fù)凍融,，破碎效果不好，就采用超聲波破碎）,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。
B,、植物細胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液,，使細胞濃度達到100萬/ml左右，置于冰盒上,，用超聲破碎儀,，設(shè)置破碎2s，冷卻30s的方式,，充分破碎細胞,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。
（2）組織的細胞
切割標本后,，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,，用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），去除上清,，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細胞三遍,。再用上述的細胞破碎方法破碎細胞。
3,、土壤：稱取1g土壤,，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工將標本充分混勻,。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細收集上清。分裝一份待檢測,，其余冷凍備用,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。如果是測分泌蛋白,，直接取上清檢測,，測試細胞內(nèi)蛋白，要破碎細胞,。
4,、咽拭子：加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS，溶解咽拭子頭部,，搖勻,，用鑷子取出咽拭子并擠干液體，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細收集上清,。分裝一份待檢測，其余冷凍備用,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。如果是測分泌蛋白,，直接取上清檢測，測試細胞內(nèi)蛋白,，要破碎細胞,。
5. 植物標本的采集及保存
1、 稱取0.1g（誤差±3%以內(nèi)）新鮮植物組織樣本,，在液氮中充分研磨,；
2、 加入1ml的提取液（80%甲醇）, 置于-20度過夜,；
3,、 于4度，8000rpm,，離心1小時,，取上清；
4,、 上清液過C-18固相萃取柱,。具體步驟是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%yi醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循環(huán)。過柱后的樣本真空干燥或氮氣吹干,，保存?zhèn)溆茫?br style="box-sizing: border-box; margin: 0px; padding: 0px;"/>5,、 上樣前加入pH7.4 PBS緩沖液（1ml定容）?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘,，然后4度離心（8000rpm，15分鐘）,，取上清并暫時保存于4度待用,。

樣本收集注意事項
1,、不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。
2,、標本采集后盡快進行實驗，若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3,、我們羅列的是通用的樣本處理方法,，無法涵蓋各種樣本，對于一些特殊樣本,，建議實驗人員多參考已發(fā)表的文獻,，自行設(shè)計合理的樣本處理方法。