TRAP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

雅吉生物的抗酒石酸酸性磷酸酶染色液以萘酚AS-BI為底物，細(xì)胞內(nèi)被酸性磷酸酶水解釋放出磷酸和萘酚,，萘酚與重氮鹽偶聯(lián)生成有色產(chǎn)物,，定位于細(xì)胞質(zhì)中，若細(xì)胞內(nèi)的ACP有抗酒石酸的活性,，則呈陽(yáng)性反應(yīng),。 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP/TRACP)主要存在于正常人肺泡巨噬細(xì)胞等部位的TRAP和存在于細(xì)胞白血病人脾臟TRAP均在細(xì)胞濾泡中，并不釋放入血液,，血液中TRAP絕大部分來(lái)源于破骨細(xì)胞,。因而測(cè)量血液中TRAP可以了解破骨細(xì)胞的功能狀態(tài)。 抗酒石酸酸性磷酸酶為骨吸收和破骨細(xì)胞活性的良好標(biāo)志物, 測(cè)定TRACP有助于了解生理?xiàng)l件和各種病理?xiàng)l件下的骨代謝狀況,。存在于正常人肺泡巨噬細(xì)胞和白血病人脾臟的抗酒石酸酸性磷酸酶均在細(xì)胞濾泡中,，并不是釋放入血液。血液中的TRAP絕大多數(shù)來(lái)源于破骨細(xì)胞,，因此可以通過(guò)測(cè)量血液中的TRAP了解破骨細(xì)胞的功能狀態(tài),。　

TRAP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)試劑盒組成：

自備材料：

光學(xué)顯微鏡,、染缸,、移液器、秒表,、冰盒,、純水、載玻片,、吸頭,、一次性手套

適用樣本

1. 石蠟切片

2. 冰凍切片

3. 細(xì)胞涂片，爬片

4.血涂片等

操作步驟(僅供參考)：

工作液的配制:

1．底物反應(yīng)液B的配制：使用前用移液器將試劑B2吸入試劑B1中,，溶解混勻,，配成甲液,；將試劑B4吸入試劑B3中，溶解混勻,，配成乙液,。將甲液和乙液混勻即成底物反應(yīng)液B。

2．底物反應(yīng)液C的配制：使用前用移液器將試劑C2吸入試劑C1中,，溶解混勻,，即成底物反應(yīng)液C。

3．底物反應(yīng)液E的配制：使用前用移液器將試劑E2吸入試劑E1中,，溶解混勻,，即成底物反應(yīng)液E。

4．底物孵育液的配制：在染色缸中加入30ml蒸餾水,，37℃水浴10分鐘,。將底物反應(yīng)液B、C,、D,、E依次加入已預(yù)溫的蒸餾水中混合并充分混勻。

注意：所有的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,，請(qǐng)使用前新鮮配制,，配制后立即使用，一次使用完,，不可放置,。

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樣本的染色處理：

一、血涂片及骨髓涂片

1,、推片：

取全血或骨髓3ul左右置載玻片上,，將推玻片保持與載玻片30°角，置于血滴正前方,，稍微往后移與血滴接觸，血滴沿推片下緣散開(kāi),，再勻速沿載玻片平面平穩(wěn)向前滑動(dòng),，至血滴鋪完血膜為止。不要太薄,，以免細(xì)胞太少,，也不要太厚，以免太重疊,。

2,、固定：

讓涂片在空氣中自然晾干，再放入本試劑盒中的固定液A中固定2-3分鐘,，水洗30-60秒,。

3,、孵育：

水洗后還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會(huì)變差,。

4,、復(fù)染：

孵育完后，取出水洗1分鐘,，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染,。可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘,，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘,，兩者任選其一即可。

二,、細(xì)胞涂片及細(xì)胞爬片

1,、固定：

將細(xì)胞涂片或細(xì)胞爬片放入本試劑盒中的固定液A中固定2-3分鐘，水洗30-60秒,。

2,、孵育：

水洗后還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會(huì)變差,。

3,、復(fù)染：

孵育完后，取出水洗1分鐘,，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染,。可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘,，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘,，兩者任選其一即可。

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三,、冰凍切片

1,、回溫：

將保存在-20℃冰箱中的冰凍切片放置到切片架上回溫5-10分鐘?？梢苑旁?7℃孵箱中進(jìn)行回溫,，或者將切片架放置在一個(gè)小盒子中，將盒子置于37℃水浴鍋中進(jìn)行回溫,。

2,、水合：

將回溫好的切片，水中浸泡1-2分鐘,。

3,、固定：

讓切片在空氣中自然晾干，再放入本試劑盒中的固定液中固定2-3分鐘,，水洗30-60秒,。

4,、孵育：

水洗后還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會(huì)變差,。

5,、復(fù)染：

孵育完后，取出水洗1分鐘,，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染,。可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘,，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘,，兩者任選其一即可。

四,、石蠟切片

1,、脫蠟：

二甲苯中脫蠟5-10分鐘。再換用新鮮的二甲苯脫蠟5-10分鐘,。

2,、浸泡：

無(wú)水乙醇浸泡5分鐘。再分別用90%,、70%乙醇各2分鐘,。

3、水合：

蒸餾水中浸泡2分鐘,。

4,、孵育：

還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會(huì)變差,。

5,、復(fù)染：

孵育完后，取出水洗1分鐘,，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染,。可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘,，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘,，兩者任選其一即可。

結(jié)果分析：

陽(yáng)性反應(yīng)為鮮紅色或深紅色顆粒,，定位于胞漿中,。

常見(jiàn)問(wèn)題：

1細(xì)胞誘導(dǎo)不成功,？

細(xì)胞系或原代BMM細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞時(shí),，細(xì)胞因子的質(zhì)量很重要。誘導(dǎo)效果不好時(shí)可以考慮調(diào)整誘導(dǎo)條件,，提高RANKL濃度或者嘗試是否添加M-CSF,。

2.如何判斷陽(yáng)性細(xì)胞,？

一般不通過(guò)形態(tài)變化說(shuō)明，RAW細(xì)胞非常形態(tài)非常多樣,，形態(tài)變化并不能說(shuō)明問(wèn)題,。一般認(rèn)為多核加上TRAP陽(yáng)性才能說(shuō)是多核破骨細(xì)胞。

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注意事項(xiàng)：

1.TRAP孵育液易失效,，本法宜用皮膚穿刺血涂片,，晾干后應(yīng)及時(shí)染色；

2.對(duì)冰凍切片染色時(shí),，應(yīng)減少切片在室溫暴露的時(shí)間,。

3.樣本需新鮮，取材后應(yīng)立即處理,，否則會(huì)影響酶的活性,。

4.組織固定需在4℃冰箱進(jìn)行，時(shí)間不宜超過(guò)24h,，否則酶活性會(huì)減弱或消失,。

5.一般不建議用石蠟切片。如果需要用石蠟切片,，組織在石蠟包埋時(shí),，溫度不宜高于56℃。應(yīng)使用熔點(diǎn)為52～54℃的石蠟進(jìn)行浸蠟,，浸蠟時(shí)間要短,，否則酶活性會(huì)減弱或消失。

6.石蠟切片不需要固定,。

有效期：2-8 ℃避光有效期為三個(gè)月

        注：拆封后請(qǐng)盡快使用,，有效期為試劑盒未拆封并嚴(yán)格按要求條件保存的有效期。

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