AO/PI雙染試劑盒說明書

一,、產(chǎn)品簡介及特點(diǎn)：

AO/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是采用AO/PI探針雙染細(xì)胞核的方法檢測凋亡細(xì)胞的狀態(tài),，是細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)研究常用的染色方法。

叩啶橙(Acridine Orange,，AO）為一種具有細(xì)胞膜通透性的熒光染料,，該染料能透過活細(xì)胞膜，使核DNA和RNA染色,。它與細(xì)胞中 DNA和RNA結(jié)合量存在差別,，復(fù)合物可發(fā)出不同顏色的熒光,，AO 與dsDNA結(jié)合時(shí)發(fā)出綠色熒光，而與ssDNA和RNA結(jié)合時(shí)發(fā)出紅色熒光,。當(dāng)與 DNA結(jié)合時(shí),，它與熒光素在光譜上非常相似，激發(fā)最大值為502nm,，發(fā)射最大值為525nm(綠色),。當(dāng)它與RNA結(jié)合時(shí)，激發(fā)最大值移至460nm（(藍(lán)色),，發(fā)射最大值移至650nm(紅色),。

在熒光顯微鏡下觀察，葉啶橙可透過正常細(xì)胞膜,，使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光;而在凋亡細(xì)胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片斷,，形成凋亡小體,。叫啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光，或黃綠色碎片顆粒;而壞死細(xì)胞黃熒光減弱甚至消失,。

Propidium lodide是一種 DNA結(jié)合性染料,，其激發(fā)和發(fā)射波長分別為488nm和630nm,產(chǎn)生紅色熒光，但無膜通透性,，不能透過活細(xì)胞膜,，只能染死細(xì)胞。因此,，在熒光顯微鏡下觀察,，正常細(xì)胞不能著色，早期凋亡細(xì)胞呈微弱紅光,，晚期凋亡細(xì)胞紅光加強(qiáng),，壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色熒光。

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二,、產(chǎn)品組成：

三、自備材料：

1,、熒光顯微鏡,、激光共聚焦,、流式細(xì)胞儀,、離心機(jī)、移液器,、冰箱,、冰盒

2、PBS緩沖液(pH7.4,，實(shí)驗(yàn)室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液（1X）)

3,、離心管、吸頭,、一次性手套

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四、操作步驟(僅供參考)：

染色工作液配制:

1．根據(jù)樣品數(shù),，按下列比例配制染色緩沖液,。取100 uL試劑C用900 uL純水稀釋，充分混勻即成染色緩沖液,。

2．每500 uL染色緩沖液加入5 uL AO染色液和10 uL PI染色液,，充分混勻，即成染色工作液,。

【注】:不同細(xì)胞樣本的染色濃度和時(shí)間有差異，可以根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整染液濃度,。以上條件適合大多數(shù)細(xì)胞樣本,。

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懸浮細(xì)胞染色

1. 收集樣本細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量在10X105個(gè)以內(nèi),。

2. 用PBS洗滌細(xì)胞兩次。

3. 用500 uL染色工作液將細(xì)胞重懸,。

4. 輕輕混勻后4℃避光孵育10-20分鐘,。

5. 用PBS洗滌細(xì)胞。

6. 用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果,。

貼壁細(xì)胞原位染色;

1. 用PBS洗滌細(xì)胞2次,。

【注】:注意洗細(xì)胞過程不要丟失細(xì)胞,，需要離心收集漂浮細(xì)胞,。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)板中或細(xì)胞爬片上加入適量體積的染色工作液。

3. 37℃孵育細(xì)胞10～30分鐘,，不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同,?？梢杂?0分鐘作為起始孵育時(shí)間,，之后優(yōu)化體系以得到均一的標(biāo)記結(jié)果。

【注】:若染色不夠充分,，建議增加染料濃度或延長染色時(shí)間,。

4. 吸干染色工作液，用培養(yǎng)基洗培養(yǎng)板或蓋玻片2~3次,，每次用預(yù)熱的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞,，然后吸干培養(yǎng)基。

結(jié)果分析:

在熒光顯微鏡下,，選用488 nm激發(fā)光鏡檢:

AO染色正常細(xì)胞DNA呈均勻黃色或黃綠色,，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。

當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí),，染色質(zhì)濃縮,，細(xì)胞核碎裂成點(diǎn)狀,，被染成大小不一,、致密濃染。壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色熒光,。

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五,、注意事項(xiàng)：

1,、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底,，避免開蓋時(shí)液體灑落,。

2、細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞,。

3、本染色試劑盒可用于細(xì)胞,、細(xì)胞涂片等,。以下以懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的熒光顯微鏡檢測為例，其他方法請(qǐng)參閱相關(guān)資料,。

4,、貼壁細(xì)胞可以消化下來染色，也可以直接原位染色,。

5,、所有細(xì)胞都染成了紅色和綠色，沒法區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞?

AO/PI染色是一種凋亡形態(tài)學(xué)的染色方法,需要染色后結(jié)合核酸的形態(tài)變化進(jìn)行分析,，不是通過顏色差異進(jìn)行細(xì)胞類型的區(qū)分。

AO染色是既有綠色也有紅色的,，它與細(xì)胞中DNA和 RNA結(jié)合量存在差別,，復(fù)合物可發(fā)出不同顏色的熒光,。AO 與dsDNA 結(jié)合時(shí)發(fā)出綠色熒光，而與 ssDNA和RNA結(jié)合時(shí)發(fā)出紅色熒光,。

染色后觀察核酸的形態(tài),，正常細(xì)胞DNA呈均勻黃色或黃綠色，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,。當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí),，核染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂成點(diǎn)狀,，被染成大小不一、致密濃染,。壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色熒光,。

凋亡細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，連接消失,，與周圍的細(xì)胞脫離,，細(xì)胞質(zhì)密度增加，核質(zhì)濃縮,，核膜核仁破碎,，DNA降解成為小片段，形成凋亡小體,。

六,、有效期：2-8 ℃避光有效期為半年

        注：拆封后請(qǐng)盡快使用，有效期為試劑盒未拆封前按要求條件保存的有效期,。

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