導(dǎo)讀

除了在蛋白質(zhì)翻譯中的作用外,，tRNA可以被切割成較短的生物活性片段，稱為tRNA片段（tRFs）,。來自精細胞的特定tRFs可以引起第二代小鼠中代謝紊亂,。因此,，種系細胞中的tRFs是表觀遺傳的一種機制，然而壓力和毒素會導(dǎo)致tRFs模式的改變,。華盛頓大學(xué)婦產(chǎn)科臨床研究部的研究人員在MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION上發(fā)表題為《Men who inject opioids exhibit altered tRNA-Gly-GCC isoforms in semen》的文章,。本研究對注射阿片類藥物（一個重要的壓力源）是否會影響生殖細胞中的tRFs感興趣。研究者對來自注射阿片類藥物病人(PWID)和非藥物使用對照組精液來源外泌體及精母細胞進行了RNA測序,。測序后采用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)驗證數(shù)據(jù),，該技術(shù)的應(yīng)用為藥物濫用相關(guān)生育問題的研究提供了新的策略和方法,。

阿片類藥物濫用對生殖系統(tǒng)的影響一直備受關(guān)注。近期一項研究揭示了注射阿片類藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體的變化,。該研究通過數(shù)字PCR技術(shù)檢測tRNA-Gly-GCC外泌體,，發(fā)現(xiàn)未注射阿片類藥物的男性與注射阿片類藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體存在顯著差異。

tRNA-Gly-GCC外泌體在精子發(fā)生和成熟過程中扮演關(guān)鍵角色,。研究結(jié)果表明,，這些差異可能與精子質(zhì)量和生育能力的下降有關(guān)。naica^®微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)在本研究中的應(yīng)用,，不僅提供了高靈敏度和高準確性的檢測方法,，對揭示阿片類藥物對生殖系統(tǒng)的影響具有重要意義。

應(yīng)用亮點：

?  naica^®微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)可以在RNA濃度低于檢測下限的樣品中檢測兩種tRFs形式,。

? naica^®微滴芯片數(shù)字PCR結(jié)果與RNA測序結(jié)果具有很好的相關(guān)性,，但比測序具有更高的靈敏度和準確性，有助于深入了解長期使用阿片類藥物的生物學(xué)影響,。

研究結(jié)果：

▲圖１.男性長期使用阿片類藥物導(dǎo)致精子中tRF-Gly亞型比例的變化,使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)定量tRFs,。成熟精子細胞通過45-90% Percoll梯度純化，并使用核苷素試劑盒分離小RNA,。cDNA使用一種特定的莖環(huán)RT引物與“長”tsRNA亞型（53個核苷酸長）或另一種靶向“短”tsRNA變體（32個核苷酸長）的特定RT引物生成,。（A）每微升cDNA中“長”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（B）每微升cDNA中“短”tRF Gly-GCC亞型的濃度,。（C）“長”與“短”tRF Gly-GCC亞型的比例,。（D）每微升cDNA中miR100-5p的濃度?！癈”：對照組（不注射藥品的男性）;“PWID”：阿片藥物注射組,。P值通過單尾曼-惠特尼U檢驗計算。對照組：n=10,，PWID組：n=13,。

研究發(fā)現(xiàn)，對照組中超過90%的reads到較短的Gly-GCC tRF,，而在PWID中只有45%的讀數(shù),。相比之下，對照組中只有4.1%的reads到更長的tRF,，而PWID為45.6%,。PWID的長/短tRF比顯著高于對照組。同時發(fā)現(xiàn)精液來源的外泌體中小核仁RNA（snoRNA）表達差異,。盡管無法確立PWID的發(fā)現(xiàn)與阿片類藥物使用之間的直接聯(lián)系,，但研究表明阿片類藥物注射和/或相關(guān)多藥使用習慣和生活方式改變可能會影響表觀遺傳。這為阿片類藥物使用的可遺傳影響提供了證據(jù)，并為進一步研究其跨代健康影響的機制奠定了基礎(chǔ),。

數(shù)字PCR技術(shù)在研究PWID中差異表達的tRFs方面發(fā)揮了重要作用,。由于精液中含有復(fù)雜的細胞混合物，意味著其中含有抑制劑,，對于PCR的擴增有很大影響。但數(shù)字PCR有抗抑制劑干擾的特點,，所以對于這類復(fù)雜樣本的檢測更為適用,。文章中數(shù)字PCR和測序各自發(fā)揮了作用：測序用于發(fā)現(xiàn)長tRF和短tRF，而數(shù)字PCR則準確檢測了tRF片段的表達差異,，進而驗證了測序的結(jié)果,。這一發(fā)現(xiàn)表明，數(shù)字PCR在研究tRFs和其他非編碼RNA片段方面具有顯著的優(yōu)勢,。數(shù)字PCR不僅可以在tRFs和其他類似的研究中提供更為精確的結(jié)果,，還可以在諸如癌癥、遺傳學(xué)和傳染病等領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用,。

naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng),，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增,，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測,，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標基因的juedui拷貝數(shù)濃度,。