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細胞轉(zhuǎn)染成敗的原因分析
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轉(zhuǎn)染是否成功的影響因素很多,，如需要轉(zhuǎn)染的細胞類型（對于困難的細胞系尤其如此）,，需要被轉(zhuǎn)染的分子（DNA、RNA,、寡核苷酸,、蛋白質(zhì)），轉(zhuǎn)染試劑等,。但無論在何種情況下,，轉(zhuǎn)染的成功均取決于轉(zhuǎn)染效率、低細胞毒性以及重現(xiàn)性這幾個要素,。
1,、載體DNA
總則：對純化所得的載體進行質(zhì)量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細胞體系,。在測定細胞體系的參數(shù)時,，一定要選用一種已知具有功能的載體做對照。
·載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性,。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例,、雙螺旋斷裂,、核酸酶的降解，以及來自于儲存和處理過程中的物理壓力的影響,。
·載體制備物——各種載體是按照不同的方案在細菌體系中制備并純化,。制備產(chǎn)物中殘余的污染物（如CsCl，內(nèi)毒素）可能會影響轉(zhuǎn)染效率,。
·載體構(gòu)造（啟動子/增強子/ORI）——轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強病毒調(diào)節(jié)元件（如,，RSV，CMV,，和SV40）的對照載體進行優(yōu)化和比較,。然而，病毒啟動子/增強子體系的相對有效性在不同細胞系間的差異可大到兩個數(shù)量級,。例如,，在某些細胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴增,，SV40體系可表達large T抗原（如,，COS）；而在其他許多細胞系中,，則是CMV啟動子更為有效,。
除此之外，各種CMV載體的表達率也會有超過一個數(shù)量級的差異,，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的,。
2、細胞
·貼壁細胞相比較懸浮細胞——在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細胞和懸浮細胞之間的差異顯著,。相對于貼壁細胞（如HEK,，CHO），懸浮細胞（如HL 60,，Jurkat）非常難以轉(zhuǎn)染,，可能是因為細胞間膜結(jié)構(gòu)的差異，但目前還沒有分子水平上合理機制的解釋,。
·分裂細胞相比較非分裂細胞——分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA,。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板,。同樣重要的是細胞在種板進行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài),；此外，還常用促有絲分裂刺激物（如,，病毒轉(zhuǎn)化,，生長因子，條件培養(yǎng)基,，以及滋養(yǎng)細胞）來活化原代培養(yǎng)細胞,。
·分板方案——在對培養(yǎng)細胞進行分板傳代培養(yǎng)之前,，必須把貼壁細胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細胞功能受到嚴重損害,。因此分批方案的不同（如,，胰蛋白酶消化時間的長短，胰蛋白酶的滅活等）需要優(yōu)化,。
·傳代次數(shù)——傳代次數(shù)是指對一個細胞系進行分批傳代的頻度（通常在一個實驗室范圍內(nèi)）,。某些細胞系相比較其他細胞系而言較不穩(wěn)定，可能會隨著培養(yǎng)時間的延長而改變,，視不同的細胞系和培養(yǎng)條件而定,。因此名稱相同的同一細胞系在生理學(xué)和形態(tài)學(xué)（以及轉(zhuǎn)染能力）性質(zhì)也可能會有很大的差異。一般而言,，細胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們*復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。
·細胞數(shù)量（融合率）——只要培養(yǎng)基質(zhì)（組織培養(yǎng)皿）尚有空間,，細胞就會按指數(shù)規(guī)律分裂,。對于正常細胞而言，細胞生長的速度受細胞密度大小的抑制（接觸抑制）,，但癌細胞則不受此限制而會繼續(xù)生長并可互相疊加,。營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細胞生長。細胞會因受到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染,。報告基因的表達率與轉(zhuǎn)染開始時的細胞數(shù)量和細胞健康以及細胞溶解之前的生長情況相關(guān),。
·培養(yǎng)物污染——培養(yǎng)物可被細菌、酵母,、真菌,、病毒、支原體,、甚至其他細胞種類所污染,。各種污染都會導(dǎo)致產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。
·支原體污染——支原體污染在所有培養(yǎng)細胞中的比例為5-35%,，它可改變細胞生長特性,，酶的作用途徑，細胞膜的組成,，染色體結(jié)構(gòu),，以及轉(zhuǎn)染效率。特別是,，支原體對采用脂質(zhì),、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾,，其結(jié)果致使非典型轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染效率偏低,。這些影響會導(dǎo)致實驗結(jié)果的不可靠以及時間和珍貴細胞系的損失,。和細菌及真菌不同，支原體污染無法通過視覺檢查發(fā)現(xiàn),。它們非常小甚至能夠通過大多數(shù)的無菌濾膜,；它們還對常用抗生素有抗藥性。所以必需進行支原體污染的常規(guī)篩查,。
3,、交叉污染
如果同一個實驗室同時培養(yǎng)不同種類的細胞，那就有可能發(fā)生交叉污染,，即使遵循zui嚴格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生,。如有許多細胞系被HeLa細胞所污染。和其他細胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn),。如果有少量某種生長快速的細胞摻入到培養(yǎng)細胞種,，幾個月過后它們就會*取代目標(biāo)培養(yǎng)物。
4,、組織培養(yǎng)試劑
一般原則：優(yōu)化您的細胞生長條件,。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更,。
·基礎(chǔ)培養(yǎng)基——培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)（氨基酸,，葡萄糖），維生素,，無機鹽,，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定,，因此如果在使用時不是新鮮,，加入就可能會產(chǎn)生問題。配置時要使培養(yǎng)基務(wù)必避光保存,；因為已知有一些組分和緩沖物質(zhì),，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì),。
·胎牛血清——血清是一種含有白蛋白,、球蛋白、生長促進因子和生長抑制因子的極為復(fù)雜的混和物,。采集血清所用動物的年齡,、營養(yǎng)水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量，從而引起顯著生物學(xué)變化,。
·添加劑——某些細胞的生長依賴于一些對生命力或細胞分裂*的物質(zhì)（如,，生長因子，微量元素,，必需代謝物和蛋白等）,。
·CO2培養(yǎng)箱——細胞生長所需環(huán)境為37℃,、相對濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值,，細胞生理對pH的變化非常敏感,，因此多數(shù)細胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2 濃度為5%來有效控制pH值,，而另一些則需要10%的CO2,。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對一下適當(dāng)?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致（溫度,、濕度和CO2）則會導(dǎo)致實驗結(jié)果的板間變異,。來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì),，或真菌/細胞的污染也都可能影響到細胞生理,。
5、瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
制備一種穩(wěn)定細胞系的*步是選擇一種同時含有選擇性標(biāo)記物和目的基因的載體,。選擇性標(biāo)記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或者酶來幫助細胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因,。
一旦選好了質(zhì)粒載體，無論瞬時或者穩(wěn)定表達都采用一樣的轉(zhuǎn)染方法,。在加入選擇性試劑之前，被轉(zhuǎn)染的細胞至少要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,。這樣就使細胞有時間表達足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用,。細胞于是在加有選擇性試劑的培養(yǎng)基中生長。那些未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞即被殺死,。而只有那些成功轉(zhuǎn)染的細胞能夠生長,。有的時候，還可以將選擇性試劑持續(xù)加入到培養(yǎng)基中,，以維持對細胞的選擇壓力,。
6、轉(zhuǎn)染方案
一般原則：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案,；首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開始,，然后通過改變試劑/DNA的配比和復(fù)合物的劑量進行優(yōu)化。
·轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備——諸如轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比,，離子強度,，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能,。質(zhì)?？捎脽o菌水或TE緩沖液稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑,，就應(yīng)當(dāng)仔細閱讀該試劑所提供的使用說明,。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物,；如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清，它就會對轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制,。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的*孵育時間是一個非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié),，對于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。
轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比（負載比）——所有的轉(zhuǎn)染試劑都會在某一個試劑/DNA配比時zui有效,。有時候這種*配比的所在范圍非常狹窄,；對于每種實驗體系都必須進行優(yōu)化才能得到*配比。
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