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【THUNDER小課堂】視網(wǎng)膜相互作用的可視化助力眼部疾病的研究
對小鼠整個視網(wǎng)膜進行快速,、清晰的高對比度成像，以研究內(nèi)皮細胞,、血管,、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞之間的相互作用,。
本文描述通過使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）技術(shù)高效地研究小鼠視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細胞、血管,、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞之間的相互作用,。視網(wǎng)膜血管疾病一般是視力受損的主要原因?；蛲蛔儠?dǎo)致人體視網(wǎng)膜血管發(fā)生改變,，進而引發(fā)家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變（FEVR）、諾里病,、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP）或Coats病,。
視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細胞、血管,、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞之間的相互作用可使用小鼠視網(wǎng)膜模型來進行研究。通過整個視網(wǎng)膜制樣和高分辨率熒光成像可觀察視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)和細胞相互作用的信息,。
簡介
視網(wǎng)膜血管疾病是導(dǎo)致視力受損和失明的主因[1],。大多數(shù)哺乳動物的視網(wǎng)膜由三層血管網(wǎng)絡(luò)形成，其中包括兩個視網(wǎng)膜內(nèi)毛細血管床,。在人體內(nèi),，基因突變會引發(fā)家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變（FEVR）、以及周邊視網(wǎng)膜血管化不完整為特征的遺傳性疾病,、如諾里病,、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP）或Coats病[1]?；加羞@些疾病的視網(wǎng)膜血管都有所改變,。科學(xué)家利用小鼠視網(wǎng)膜模型來研究視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細胞,、血管,、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞間的相互作用。利用整個視網(wǎng)膜制片來展示視網(wǎng)膜血管[1],。固定并染色后,，必須對整個視網(wǎng)膜進行高分辨率成像，以觀察整個血管網(wǎng)絡(luò)及單細胞相互作用,。本文將展示如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）高效地研究小鼠視網(wǎng)膜細胞間的相互作用[2,，3],。
挑戰(zhàn)
如何對整個視網(wǎng)膜進行快速成像，并獲得清晰的高對比度3D成像結(jié)果,，展示重要細節(jié)對研究視網(wǎng)膜至關(guān)重要,。視網(wǎng)膜成像一般使用共聚焦顯微鏡進行掃描，但是這種方法要花費數(shù)小時才能采集到整個視網(wǎng)膜圖像,。而常規(guī)的寬場顯微雖然成像速度快,，檢測靈敏度高，但是對厚標本的成像,，如整個視網(wǎng)膜,，通常會出現(xiàn)非焦平面干擾導(dǎo)致模糊，降低對比度[2,，3],。
方法
使用THUNDER Imager 3D Cell Culture儀器對整個視網(wǎng)膜進行成像。使用抗CD31抗體標記視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞（黃色）,，使用IsoB4標記視網(wǎng)膜血管和小膠質(zhì)細胞（品紅色）,，并使用抗GFAP抗體標記星形膠質(zhì)細胞（青色）。觀察整個視網(wǎng)膜時,，采用3個熒光通道,，用20x Plan Apo 0.8 NA（數(shù)值孔徑）物鏡和100個視野拼接、厚度為15-μm進行 Z軸堆棧成像,。
結(jié)果
Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,，3]方法可清晰展示視網(wǎng)膜內(nèi)的內(nèi)皮細胞、小膠質(zhì)細胞和星形細胞間的相互作用（見圖1）,。一般情況下,，通過寬場顯微鏡很難觀察到視網(wǎng)膜中的這些細胞。通過THUNDER Imager 3D Cell Culture進行高速采集,，可在幾分鐘時間內(nèi)采集到大約24 GB的整個視網(wǎng)膜成像,。采用LAS X Navigator軟件中焦平面矯正的方法，可以保證視網(wǎng)膜樣本每一個位置都處于最佳焦平面,。
圖1：使用THUNDER Imager 3D Cell Culture整個視網(wǎng)膜制片的zui大化投影圖像：A) 寬場原始數(shù)據(jù)和 B) LVCC結(jié)果,。插圖所示為單個內(nèi)皮細胞（黃色， CD31抗體）,、血管和小膠質(zhì)細胞（品紅色,，IsoB4）和星形細胞（青色， GFAP抗體）的寬場視圖,。圖片來源：Jiyeon Lee博士和Jeremy Burton博士,，Roche Genentech，美國加利福尼亞州南舊金山。
結(jié)論
THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,，3]與傳統(tǒng)寬場成像相比,，對整個小鼠視網(wǎng)膜成像時會顯著增強對比度，可以高效地研究內(nèi)皮細胞,、血管,、小膠質(zhì)細胞和星形細胞間的相互作用。
References：
1.H.J. Junge, S. Yang, J.B. Burton, K. Paes, X. Shu, D.M. French, M. Costa, D.S. Rice, W. Ye, TSPAN12 Regulates Retinal Vascular Development by Promoting Norrin- but Not Wnt-Induced FZD4/β-Catenin Signaling, Cell (2009) vol. 139, iss. 2, pp. 299-311, DOI: 10.1016/j.cell.2009.07.048.
2.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
3.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.
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