葉綠素a的測定方法——乙醇+分光光度法

1,、水樣的保存水樣注入水樣瓶后，應(yīng)放置在陰涼處,，并避免陽光直射,。若水樣的進一步處理需要較長時間（大于12h）,，則應(yīng)置于0℃~4℃低溫下保存,。水樣量視水體中浮游植物多少而定,，一般應(yīng)采0.5~2L。

2,、抽濾在抽濾裝置的濾器中放入GF/C濾膜,。抽濾時負壓應(yīng)不大于50kPa。抽濾完畢后,，用鑷子小心地取下濾膜，將其對折（有藻類樣品的一面向里）,，再用普通濾紙吸壓,，盡量去除濾紙上的水分。如不立即提取,，應(yīng)將濾膜放在黑暗低溫條件下保存,。在普通冰箱冷凍室中可存放幾天，在-20℃低溫冰箱中可保存30天,。

3,、提取研磨可用玻璃研缽。將濾膜剪碎放入研缽,，加入90%乙醇溶液7~ 8ml,，研磨3~5分鐘直至變?yōu)閯驖{。將研磨后的勻漿移入具塞帶刻度的離心管中,。用少量提取液沖洗研缽或勻漿器,，沖洗液并入離心管中，使終容積略小于10ml。蓋上關(guān)塞,，搖動后置于黑暗低溫處進行提取至少6-24h,。

4、離心將裝有提取液的離心管放入離心機中,，轉(zhuǎn)速3500~4000rpm,，離心10~15min。將上層葉綠素提取液移入定量試管中,，再用少量提取液清洗,、離心二次取得提取液。最后將提取液定容到10ml,。如果大批樣品需同步操作時,，可減少離心步驟，直接在提取液中浸泡濾膜6-2 4h,，取其清液即可,。

5、測定用90%乙醇溶液作為參照液（參照比色皿中盛放90%乙醇溶液,，并用90%乙醇調(diào)分光光度計零點）,。測定定容后的提取液在665nm和750nm處的吸光度，并計算兩個吸光度的差記為A1,；然后向比色皿中加入1滴1mol/L的鹽酸酸化,，酸化5—10min(可以用不同時間實驗再進行調(diào)整)后再次測定酸化后的提取液在665和750nm處的吸光度，并且把酸化后的兩個吸光度的差記為A2.則提取液中葉綠素a的濃度為：Chla=27.9×（A1－A2）×V提取液/V脫鎂葉綠素濃度為：Chla=27.9×（1.7 A2－A1）×V提取液/V其中Chla為水樣中的葉綠素a含量,，單位為ug/L,；V提取液為提取液的最終定容體積,單位為mL；V為抽濾水樣的體積,，單位為L,。