我們知道開始培養(yǎng)的細胞不能無限期地生長,，因為受限區(qū)域內(nèi)的細胞數(shù)量不斷增加,，營養(yǎng)物質(zhì)也會被消耗,，從而 導致有毒的代謝產(chǎn)物增加,，另外根據(jù)實驗或生產(chǎn)需要，也要對細胞進行 擴大培養(yǎng),。通過去除培養(yǎng)基并將細胞轉(zhuǎn)移到新鮮的生長培養(yǎng)基和基質(zhì)中,，細胞獲得了新鮮的營養(yǎng)并去除了有毒代謝物，從而可以長期維持培養(yǎng),。這個過程就屬于傳代培養(yǎng),，傳代培養(yǎng)的 細胞 密度會低于原始培養(yǎng)物中的細胞密度。當接種細胞后,， 細胞生長會經(jīng)過滯后期,、對數(shù)期，穩(wěn)定期 和凋亡期,。在凋亡期,，細胞會因缺乏營養(yǎng)或培養(yǎng)條件不當而死亡。貼壁細胞傳代培養(yǎng)步驟如下：
一,、細胞檢查
  細胞解凍后需要進行細胞狀態(tài)檢查,，確保細胞生長狀態(tài)正常，確保無細菌污染,、無支原體污染,。培養(yǎng)貼壁細胞時，主要貼壁于培養(yǎng)皿或燒瓶底部,，培養(yǎng)基呈粉橙色,。由于培養(yǎng)基中細胞（或污染）的代謝產(chǎn)物酸化，pH 指示劑酚紅變黃,。MDCK 細胞在對數(shù)生長期呈多邊形,，單層生長。使用正常的明場照明很難看到它們,。通過切換到相襯,，可以更容易地識別細胞。
記錄細胞狀態(tài)對于確保實驗結(jié)果一致非常重要,。通過活細胞成像儀可以通過遠程控制輕松成像和保存,。研究人員可以拍攝細胞圖像以跟蹤培養(yǎng)狀態(tài)并將圖像傳輸?shù)街悄茉O備或 U 盤。


二,、細胞收獲
1.將培養(yǎng)基從細胞中吸出到廢物容器中,。也可以使用連接到瑞寧的真空吸液器。
2.用 5 ml 不含 Ca 和 Mg 的預熱 PBS 小心洗滌細胞最多 3 次,，以去除殘留培養(yǎng)基中的胎牛血清 (FBS),。FBS 或 FBS 替代品會抑制胰蛋白酶。加入 3 ml 含EDTA的胰蛋白酶并輕輕晃動覆蓋貼壁的細胞并在 37°C的水浴鍋中孵育并解離細胞,。 不同的細胞系需要不同的胰蛋白酶孵育時間,。為避免過度胰蛋白酶消化會損壞細胞，請每隔幾分鐘在顯微鏡下檢查一次。
3.輕輕沖洗板并將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 50 ml 試管中,，并以 800 rpm 的速度向下旋轉(zhuǎn) 5 分鐘
分離的細胞應呈圓形并在胰蛋白酶溶液中自由漂浮,。一旦細胞分離，向培養(yǎng)皿中加入 5 ml 培養(yǎng)基以使胰蛋白酶失活,。
4. 分離的細胞應該是圓形的并且在胰蛋白酶溶液中自由漂浮,。
三、細胞計數(shù)
1. 由于臺盼藍可以選擇性地穿透死細胞的細胞膜將死細胞染成藍色,，所以使用臺盼藍溶液染色有利于觀察細胞的活力,。根據(jù)這一特點我們將100UL細胞懸浮液與100UL的 0.4% 的臺盼藍溶液混合均勻后，再進行細胞觀察,。
2.將移液器吸頭放在蓋玻片邊緣并輕輕排出細胞懸浮液,，從而將細胞懸浮液裝入計數(shù)室（每個計數(shù)區(qū)約 4 µl）。蓋玻片下的區(qū)域通過毛細管作用填充,。
3.將細胞計數(shù)板放在細胞計數(shù)儀中進行細胞計數(shù),。

四、稀釋
1.將所需體積的細胞（適當數(shù)量的細胞）以所需的分流比（此處為 1:10）吸取到新培養(yǎng)皿中,，然后用培養(yǎng)基將其加滿至每個培養(yǎng)皿中所需的體積（10 毫升）,。注意培養(yǎng)皿蓋上的細胞類型、細胞分裂日期和傳代數(shù),。將細胞放回 37°C 的培養(yǎng)箱中,。
2.以所需的分流比將所需體積的細胞（適當數(shù)量的細胞）移入新培養(yǎng)皿中。
讓細胞過夜以恢復和沉淀,。24 小時后，用顯微鏡檢查細胞的形狀,、粘附和是否存在污染,。
3.細胞應該附著在培養(yǎng)皿底部并且已經(jīng)開始生長和分裂。更換培養(yǎng)基以去除任何殘留的解離劑或細胞碎片,。培養(yǎng)細胞直到它們?nèi)诤喜蕚浜眠M行實驗或下一次傳代培養(yǎng),。
4.細胞應當附著在培養(yǎng)皿底部并開始生長和分裂。
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