液相色譜儀工作過(guò)程

　　液相色譜儀系統(tǒng)由儲(chǔ)液器,、泵,、進(jìn)樣器,、色譜柱、檢測(cè)器,、記錄儀等幾部分組成,。

　　儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi),，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過(guò)程,，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出,，通過(guò)檢測(cè)器時(shí),，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng),、輸液系統(tǒng),、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),。

　　1. 進(jìn)樣系統(tǒng)

　　液相色譜儀一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作,，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的,。

　　2. 輸液系統(tǒng)

　　該系統(tǒng)包括高壓泵,、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4X10Pa,，流速可調(diào)且穩(wěn)定,，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng),，可加快其在柱中的移動(dòng)速度,，這對(duì)提高分辨率、回收樣品,、保持樣品的生物活性等都是有利的,。

　　流動(dòng)相貯存器和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變,，包括改變洗脫液的極性,、離子強(qiáng)度、PH值,，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等,。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離。

　　3. 分離系統(tǒng)

　　該系統(tǒng)包括色譜柱,、連接管和恒溫器等,。

　　色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm(需要兩根連用時(shí),，可在二者之間加一連接管)，內(nèi)徑為2～5mm,，由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成).固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去),、多孔性(孔徑可達(dá)1000)和比表面積大的特點(diǎn),，加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)，或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基,、季胺基,、羥甲基、苯基,、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物,。

　　因此，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性,。例如,，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來(lái),。另外,，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻,、致密狀態(tài),，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)。

　　基質(zhì)粒度小,，微孔淺,，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度,、提高分辨率是有益的,。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小,，塔板理論數(shù)N就越大,。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理,。再者,，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60°C，通過(guò)改善傳質(zhì)速度,，縮短分析時(shí)間,，就可增加層析柱的效率。

　　液相色譜儀常見故障處理

　　1. 氣泡溢出

　　流動(dòng)相內(nèi)有氣泡，關(guān)閉泵,，打開泄壓閥，打開purg鍵,，清洗脫氣,，氣泡不斷從過(guò)濾器冒出，進(jìn)入流動(dòng)相,，無(wú)論打開purge鍵幾次,，都無(wú)法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。

　　原因過(guò)濾器長(zhǎng)期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi),，過(guò)濾器內(nèi)部由于霉菌的生長(zhǎng)繁殖,，形成菌團(tuán)，阻塞了過(guò)濾器,，緩沖液難以流暢地通過(guò)過(guò)濾器,，空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過(guò)濾器進(jìn)入流動(dòng)相。

　　處理過(guò)濾器浸泡于5%硝酸溶液中,，超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過(guò)濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時(shí),，輕輕震蕩幾次，再將過(guò)濾器用純水清洗幾次,，打開泄壓閥,，打開purge鍵清洗脫氣，如仍有氣泡不斷從過(guò)濾器冒出,，繼續(xù)將過(guò)濾器浸泡于5%硝酸溶液中,，如沒(méi)有氣泡不斷從過(guò)濾器中冒出，說(shuō)明過(guò)濾器內(nèi)部的霉菌菌團(tuán)已被硝酸破壞,，流動(dòng)相可以流暢地通過(guò)過(guò)濾器,。

　　打開泄壓閥，打開泵,，流速調(diào)至1.0～3.0ml/min,，純水沖洗過(guò)濾器1小時(shí)左右。即可將過(guò)濾器清洗干凈,。關(guān)閉泄壓閥,，純甲醇沖洗半小時(shí)即可。

　　2. 柱壓高原因

　　(1) 緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi);(2) 樣品污染沉積,。處理對(duì)于第一種情況先用40～50℃的純水,，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后,，相應(yīng)提高流速?zèng)_洗,，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗,，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對(duì)于第二種情況,，由樣品的沉積引起污染的C18柱,，和純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗,，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定),，再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。

　　3. 既無(wú)壓力指示,，又無(wú)液體流過(guò)

　　(1)泵密封墊圈磨損;　　(2)大量氣泡進(jìn)入泵體,。處理對(duì)于第一種情況,更換密封墊圈;對(duì)于第二種情況,在泵作用的同時(shí)，用一個(gè)50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣,。

　　4. 壓力波動(dòng)大,，流量不穩(wěn)定

　　原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封,。處理工作中注意觀察流動(dòng)相的量,，保證不銹鋼濾器沉入儲(chǔ)液器瓶底，避免吸入空氣,，流動(dòng)相要充分脫氣,。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥,，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗,。

　　5. 出峰不佳，峰分叉

　　(1)色譜柱被污染;　　(2)柱頭填料塌陷,。處理對(duì)于第一種情況,先用純水反向沖洗柱子,，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定),，再換成甲醇沖洗,，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上,。

　　如沖洗后依然出峰不佳,，則考慮第二種情況。對(duì)于第二種情況,，擰開柱頭,，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料),，裝入新填料,，滴一滴甲醇，填料下陷,，再填,，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇,，再壓緊反復(fù)幾次,，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈,，擦凈柱外壁的填料,，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上,。

　　6. 峰面積重復(fù)性不佳

　　(1)進(jìn)樣閥漏液,?！?2)加樣針不到位,。　　(3)液量不足,。

　　處理對(duì)于第一種情況更換進(jìn)樣閥墊圈;對(duì)于第二種情況保證加樣針插到底,，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài),，以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確,。

　　日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要,，如要注意不要讓空氣進(jìn)入輸液系統(tǒng)和高壓泵中,，儲(chǔ)液器內(nèi)的溶液如長(zhǎng)時(shí)間未用應(yīng)清洗儲(chǔ)液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,，防止無(wú)機(jī)鹽析出或沉積;樣品的前處理也很重要,，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，溶解,，盡量減少對(duì)色譜柱的污染,，以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，同時(shí)避免注射過(guò)濃的樣品溶液,，以免殘留液在進(jìn)樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞;色譜柱作好標(biāo)記,用于不同分析目的的色譜柱不要混用等,。