CCK-8法進行細胞毒性檢測的方法

CCK-8法是細胞活力和細胞毒性檢測常用的一種檢測方法,，其具體操作方法如下：
1.制備細胞懸液：選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞制作細胞懸液，并計數(shù),。
2.在96孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔),。
3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)（37℃,，5% CO2）12-24小時，使細胞達到指數(shù)期（培養(yǎng)時間根據(jù)細胞種類的不同和每孔內(nèi)細胞數(shù)量的多少而異）,。
4.吸出各孔培養(yǎng)基,，向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測藥物進行干預。（實驗組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基,，空白組加入不含藥物培養(yǎng)基）
5.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱（37℃,，5% CO2）培養(yǎng)一段適當?shù)臅r間（例如：6、12,、24或48小時,，具體時間一般根據(jù)細胞周期來決定）。
6.每孔加入10ul CCK-8試劑,。①在做加藥實驗時,，還應考慮藥物的吸收。如果實驗中待測物質(zhì)有氧化還原劑,，在不含細胞的培養(yǎng)基中加入藥物,，然后加入CCK-8試劑在一定時間內(nèi)檢測，和不加藥物的培養(yǎng)基進行比較（只加CCK-8試劑）,，如果OD值明顯偏高,，則說明有反應。
②可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基,，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次,，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物對實驗的影響,。
③當然藥物影響比較小的情況下,，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可,。5.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時：
6.使用酶標儀檢測450nm波長的吸光度（OD值）按公式計算：
細胞活力（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
細胞抑制率（%）=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 實驗組吸光度 (含細胞,、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液),；
Ac: 對照組吸光度 (含細胞,、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液,，不含藥物),；
Ab: 空白組吸光度 (含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液,，不含細胞,、藥物)。

 
CCK-8法進行細胞活力指細胞增殖活力或細胞毒性檢測時的注意事項：
 
由于CCK-8是通過和細胞內(nèi)的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數(shù)量,，如果細胞已經(jīng)死亡,，但脫氫酶的活性還在,，則試劑測定的細胞數(shù)量將會比真實值高，不能真實反映活細胞數(shù)量,，建議采用別的方法測定,。
 
由于 CCK-8 分析基于活細胞中脫氫酶活性的檢測，因此影響活細胞中脫氫酶活性的條件或化學物質(zhì)可能會導致實際活細胞數(shù)與使用 CCK-8 分析確定的細胞數(shù)之間存在差異,。
 
考慮到不同類型細胞代謝水平存在差異,，有些細胞在藥物處理后，可能活細胞數(shù)不變,，但是有氧代謝能力降低后,，NAD+產(chǎn)生減少，測出的Formazan也會減少,。
 
CCK8可以檢測大腸桿菌,，但不能檢測酵母細胞。
 
在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染,，以免影響結(jié)果,。
 
金屬對CCK-8顯色有影響：當終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵,、硫酸銅會抑制5%,、15%、90%的顯色反應,，使靈敏度降級,。如果終濃度是10 mM的話，將會*抑制,。
 
CCK-8試劑的顏色為淡紅色,，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加,。酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會造成干擾,，可以通過減去空白孔中本底的吸光度而消除。
 
混合或重懸組分時,，避免產(chǎn)生氣泡,，因為它們會影響OD值讀取。
 
剛開始做實驗時,，建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間,。
 
CCK-8反復凍融會增加背景值，干擾實驗測定,。
CCK8的說明書大家一定要認真閱讀,，里面很多細節(jié)的問題都有提到。而且說明書里提供的一些關(guān)于各種細胞的種板數(shù)都很有參考價值，因為那是反復驗證過的最佳數(shù)值,。
CCK-8法進行細胞毒性檢測的優(yōu)勢：

1,、使用方便，CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液,，可以直接加入到細胞樣品中（懸浮和貼壁細胞均適用），不需要預配各種成分,，不需要對細胞進行過多的處理,，也不必添加放射性同位素、有機溶劑等,，且能夠快速進行檢測,；
2、CCK-8法的檢測靈敏度很高,，甚至可以測定較低細胞密度,；
3、CCK-8法的重復性優(yōu)于MTT 法,，MTT 實驗生成的formazan 不是水溶性的,，需要使用DMSO 等有機溶劑溶解；
4,、而本方法產(chǎn)生的formazan 是水溶性的,，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差,；
5,、CCK-8法對細胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時間,，與MTT 方法相比線性范圍更寬,，靈敏度更高；
6,、CCK-8 對細胞的毒性非常低,，其他的實驗，例如中性紅法或結(jié)晶紫法 ,，也可在 CCK-8 法檢測完后繼續(xù)進行,。
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