導(dǎo)讀

在病毒感染咳嗽的診斷與治療專家共識（2023，46）中針對咳黃膿痰或外周血白細(xì)胞增高提示可能存在細(xì)菌感染,，在2021年發(fā)表的95例患者合并細(xì)菌及真菌感染的臨床分析中,，結(jié)果表明，危重型患者易合并鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌等細(xì)菌和真菌的感染,，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)屬于腸桿菌科克雷伯菌屬,，是一類重要的醫(yī)源性感染革蘭氏陰性條件致病菌，對多數(shù)抗菌藥物易產(chǎn)生耐藥性,，占臨床分離菌的13%，成為僅次于大腸埃希菌 (19%)的院內(nèi)感染第二大致病菌,。

上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物代謝國重實驗室科學(xué)家基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)建立了肺炎克雷伯菌的數(shù)字PCR檢測方法,。數(shù)字PCR檢測靈敏度檢出限可達(dá)到3.37copies/μL；方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,，RSD)均小于25%,；本研究利用優(yōu)化后的數(shù)字PCR方法共檢測了28 株臨床菌株，檢測到14株為肺炎克雷伯菌,，14株為其他種屬,，該方法特異性好、靈敏度高,、準(zhǔn)確度高,，適合肺炎克雷伯菌的核酸檢測和定量分析，也為其他臨床病原菌的分子檢測提供了新的技術(shù)參考,。

應(yīng)用亮點：

?  數(shù)字PCR (digital PCR,，dPCR)作為第3代 PCR技術(shù)，具有簡便快速,、靈敏度高,、精確度高的特點，可檢出微量的細(xì)菌核酸分子。

? 與傳統(tǒng)的qPCR 相比,，dPCR不受擴增效率的影響,，無需依賴擴增曲線、無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可進(jìn)行定量,，同時對低濃度的核酸定量更加準(zhǔn)確可靠,。

實驗結(jié)果：

１、通過數(shù)字PCR的檢測范圍和靈敏性實驗得到,，cdPCR樣品后續(xù)可在S5?S9樣本檢測范圍內(nèi)進(jìn)行,。

▲圖１.數(shù)字PCR對不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度測試結(jié)果。藍(lán)色：陽性微滴,；灰色：陰性微滴,；NTC：陰性對照

２、數(shù)字PCR與熒光定量PCR的檢出范圍和靈敏性實驗,，得到cdPCR對低濃度樣品的檢測更準(zhǔn)確,。此外，cdPCR的檢出限(3.37copies/μL),，較qPCR (194.9 copies/μL) 有更高的檢測靈敏度,。

▲圖2: pUC57-16S的數(shù)字PCR (A)和熒光定量PCR (B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 2B不同稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測的Ct值：

S1：9.84；S2：12.89,；S3：16.21,；S4：19.74；S5：22.34,；S6：25.69,；S7：28.11；S8：32.56,；S9：35.42

３,、同時對3株肺炎克雷伯菌和4株其他菌株進(jìn)行特異性評估驗證，cdPCR方法對肺炎克雷伯菌的特異性檢測有效,。

4,、利用cdPCR對28株臨床菌株進(jìn)行檢測，有14株菌為肺炎克雷伯菌,，14株為其他菌株,，說明cdPCR具有臨床菌株檢測應(yīng)用潛力。

綜上所述,，本研究建立了檢測肺炎克雷伯菌的數(shù)字PCR方法,。與qPCR技術(shù)相比，cdPCR可以精準(zhǔn)地對核酸進(jìn)行定量分析,，檢測下限低至單拷貝,，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線,， 具有較好的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，在稀有樣品或痕量樣品的檢測方面具有的優(yōu)勢,。因此,，該方法為提高肺炎克雷伯菌的早期核酸檢測提供了新方法，也為核酸定量提供了新的數(shù)據(jù)支持,。

同時naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)為合并細(xì)菌感染的多重檢測提供可能,。

naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù),，自動化微滴生成和擴增,，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進(jìn)行質(zhì)控,，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標(biāo)基因的拷貝數(shù)濃度,。