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藥物傳遞系統(tǒng)DDS：是將脂質(zhì)體,、微囊,、微球,、微乳,、納米囊,、納米球、外泌體等作為藥物載體將藥物通過不同的給藥方式,，直接輸送到病灶部位的一種新型醫(yī)療方式,。
將藥物加載到外泌體
在進(jìn)行藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計(jì)時(shí)，其中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)就是載藥方法,。由于外泌體具有生物相容性,、穩(wěn)定性和腫瘤靶向性，隨著外泌體技術(shù)研究的不斷發(fā)展 使它們成為有前景的藥物載體,。外泌體的構(gòu)建類似于雙膜脂質(zhì)體,，并且藥物裝載方法也類似。但在藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計(jì)前需要根據(jù)藥物和外泌體特性仔細(xì)選擇,。
外泌體可以通過被動(dòng)或主動(dòng)方法裝載多種藥物、大分子和其他物質(zhì)（ 圖 3）,。被動(dòng)方法比較簡單,，它是基于藥物與外泌體或細(xì)胞孵育，并進(jìn)一步分離含有藥物的釋放外泌體（ 圖 3 I,、II）,。這種方法通過不同的藥物濃度梯度來實(shí)現(xiàn)；因此,，在與外泌體孵育期間,，物質(zhì)本身也 會(huì)遷移到囊泡中。這一過程可以通過施加額外的力來加強(qiáng),，例如搖動(dòng)或攪拌等.
被動(dòng)裝載法的缺點(diǎn)是裝載效率低,，輸出藥物濃度低（約 1%）。將藥物與外泌體或其他 DDS 載體一起孵育是一種較常見并 且簡單的方法,，尤其適用于疏水性藥物,。
主動(dòng)加載方法可以實(shí)現(xiàn)更高的加載效率，包括超聲處理 (可達(dá)~28%),、電穿孔 (~5%) ,、擠壓、凍融,、pH 梯度 (1.7%) 和結(jié)合方法,。具體方法是通過超聲處理和電穿孔在 外泌體膜上穿孔，再分別由聲波或電脈沖介導(dǎo)（ 圖 3 III,、IV）,。之后，外泌體將通過上述試劑誘導(dǎo)的小膜孔從溶液中加載藥物,。這些方法似乎不會(huì)改變外泌體膜的特性,，但會(huì)導(dǎo)致外泌體大小增加,。
主動(dòng)加載法的另一種方法是通過抗體或點(diǎn)擊化學(xué)將藥物與外泌體結(jié)合?？贵w將通過它們對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)元素的親和力非共價(jià)結(jié)合到外泌體表面（ 圖 3七). 化學(xué)合成將導(dǎo)致藥物通過例如 PEG 或膜蛋白與外泌體共價(jià)結(jié)合,，并且進(jìn)一步釋放取決于外泌體降解。這些方法還可以通過將特定受體引入膜來將外泌體靶向所需細(xì)胞 ,。
圖 3. 將藥物裝入外泌體的方法,。
( I )—從藥物暴露細(xì)胞中釋放的載藥外泌體，
( II )— 藥物與外泌體孵育并攪拌,，
( III )—超聲處理,，
( IV )—電穿孔，
( V )— 擠出,，
( VI )—凍融循環(huán),，
( VII )-藥物與外泌體的化學(xué)綴合。
以上步驟中提到的方法允許根據(jù)藥物的親水性和親脂性將藥物摻入外泌體或磷脂雙層的內(nèi)部,。親水性物質(zhì)將滲透于外泌體的腔內(nèi),，而可溶于脂質(zhì)的物質(zhì)將聚集在外泌體的膜上（ 圖2）。一些研究報(bào)告證明,，親水性物質(zhì)很容易加載到外泌體中,，而親脂性物質(zhì)的加載效率較低。通常,，這些物質(zhì)在體外 24 小時(shí)內(nèi)從外泌體釋放約 50% ,。
選擇藥物加載方法時(shí)需要考慮到對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)和特性的影響。目前,，通過電穿孔的聚集和融合法使用較為普遍,。
實(shí)際上，外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞分子可以遞送多種物質(zhì),，包括化療藥物（紫杉醇,、多柔比星和紫杉醇）、RNA 和 DNA等 ,。另外,，近年來還針對(duì)細(xì)菌（弓形蟲病和沙門氏菌病）,、病毒（艾滋病和乙型肝炎）,、癌癥（肺癌、胰腺癌,、結(jié)腸癌,、腦癌和乳腺癌）等進(jìn)行基于外泌體的疫苗開發(fā)設(shè)計(jì)。所以外泌體也常被用作基因編輯工具遞送的工具 ,，例如 Cas9.
給藥途徑
根據(jù)目前的研究,，外泌體主要通過靜脈內(nèi)給藥,，位置主要為肝臟肺和腦、胃中,，只有少數(shù)研究使用另一種給藥方法,，即經(jīng)鼻、口服和腹膜內(nèi)給藥,。
表 4. 外泌體的藥物,、大分子和潛在靶向策略示例。
近些年,，外泌體研究領(lǐng)域發(fā)展迅速,，來新型外泌體分離技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從小體積樣品中快速、高效,、精確地分離,，在外泌體研究也取得了許多重大進(jìn)展，這些都使外泌體成為納米藥物,、基因要等創(chuàng)新藥的遞送工具。外泌體技術(shù)的發(fā)展 對(duì)于未來的外泌體的檢測,、生物標(biāo)志物篩選以及癌癥的鑒別等也都具有重要的意義,。
選擇外泌體作為給藥載體的主要優(yōu)勢在于它可以降低藥物濃度，能夠準(zhǔn)確到病灶部位有效提高效率并減少藥物的毒副作用,。盡管如此,，外泌體的載藥效率仍有提升空間。比如：在外泌體研究領(lǐng)域中,，由于不同供體細(xì)胞分離的外泌體特性也是不同的,，需要足夠了解與熟悉各種外泌體的 特性，了解外泌體的長期毒性,、免疫原性和安全性這也是外泌體藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計(jì)的重點(diǎn),。
蘇州阿爾法生物專注于生物實(shí)驗(yàn)室儀器和生物試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材行業(yè)14年,。所提供的納米粒度儀,、熒光顯微鏡等廣泛應(yīng)用于細(xì)胞外泌體研究領(lǐng)域,。另外，提供的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備包括發(fā)酵罐,、生物反應(yīng)器,、細(xì)胞培養(yǎng)搖床、恒溫恒濕培養(yǎng)箱,、PCR儀,、乳酸分析測定儀等也廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)。
將藥物加載到外泌體
在進(jìn)行藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計(jì)時(shí)，其中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)就是載藥方法,。由于外泌體具有生物相容性,、穩(wěn)定性和腫瘤靶向性，隨著外泌體技術(shù)研究的不斷發(fā)展 使它們成為有前景的藥物載體,。外泌體的構(gòu)建類似于雙膜脂質(zhì)體,，并且藥物裝載方法也類似。但在藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計(jì)前需要根據(jù)藥物和外泌體特性仔細(xì)選擇,。
外泌體可以通過被動(dòng)或主動(dòng)方法裝載多種藥物、大分子和其他物質(zhì)（ 圖 3）,。被動(dòng)方法比較簡單,，它是基于藥物與外泌體或細(xì)胞孵育，并進(jìn)一步分離含有藥物的釋放外泌體（ 圖 3 I,、II）,。這種方法通過不同的藥物濃度梯度來實(shí)現(xiàn)；因此,，在與外泌體孵育期間,，物質(zhì)本身也 會(huì)遷移到囊泡中。這一過程可以通過施加額外的力來加強(qiáng),，例如搖動(dòng)或攪拌等.
被動(dòng)裝載法的缺點(diǎn)是裝載效率低,，輸出藥物濃度低（約 1%）。將藥物與外泌體或其他 DDS 載體一起孵育是一種較常見并 且簡單的方法,，尤其適用于疏水性藥物,。
主動(dòng)加載方法可以實(shí)現(xiàn)更高的加載效率，包括超聲處理 (可達(dá)~28%),、電穿孔 (~5%) ,、擠壓、凍融,、pH 梯度 (1.7%) 和結(jié)合方法,。具體方法是通過超聲處理和電穿孔在 外泌體膜上穿孔，再分別由聲波或電脈沖介導(dǎo)（ 圖 3 III,、IV）,。之后，外泌體將通過上述試劑誘導(dǎo)的小膜孔從溶液中加載藥物,。這些方法似乎不會(huì)改變外泌體膜的特性,，但會(huì)導(dǎo)致外泌體大小增加,。
主動(dòng)加載法的另一種方法是通過抗體或點(diǎn)擊化學(xué)將藥物與外泌體結(jié)合?？贵w將通過它們對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)元素的親和力非共價(jià)結(jié)合到外泌體表面（ 圖 3七). 化學(xué)合成將導(dǎo)致藥物通過例如 PEG 或膜蛋白與外泌體共價(jià)結(jié)合,，并且進(jìn)一步釋放取決于外泌體降解。這些方法還可以通過將特定受體引入膜來將外泌體靶向所需細(xì)胞 ,。
圖 3. 將藥物裝入外泌體的方法,。
( I )—從藥物暴露細(xì)胞中釋放的載藥外泌體，
( II )— 藥物與外泌體孵育并攪拌,，
( III )—超聲處理,，
( IV )—電穿孔，
( V )— 擠出,，
( VI )—凍融循環(huán),，
( VII )-藥物與外泌體的化學(xué)綴合。
以上步驟中提到的方法允許根據(jù)藥物的親水性和親脂性將藥物摻入外泌體或磷脂雙層的內(nèi)部,。親水性物質(zhì)將滲透于外泌體的腔內(nèi),，而可溶于脂質(zhì)的物質(zhì)將聚集在外泌體的膜上（ 圖2）。一些研究報(bào)告證明,，親水性物質(zhì)很容易加載到外泌體中,，而親脂性物質(zhì)的加載效率較低。通常,，這些物質(zhì)在體外 24 小時(shí)內(nèi)從外泌體釋放約 50% ,。
選擇藥物加載方法時(shí)需要考慮到對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)和特性的影響。目前,，通過電穿孔的聚集和融合法使用較為普遍,。
實(shí)際上，外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞分子可以遞送多種物質(zhì),，包括化療藥物（紫杉醇,、多柔比星和紫杉醇）、RNA 和 DNA等 ,。另外,，近年來還針對(duì)細(xì)菌（弓形蟲病和沙門氏菌病）,、病毒（艾滋病和乙型肝炎）,、癌癥（肺癌、胰腺癌,、結(jié)腸癌,、腦癌和乳腺癌）等進(jìn)行基于外泌體的疫苗開發(fā)設(shè)計(jì)。所以外泌體也常被用作基因編輯工具遞送的工具 ,，例如 Cas9.
給藥途徑
根據(jù)目前的研究,，外泌體主要通過靜脈內(nèi)給藥,，位置主要為肝臟肺和腦、胃中,，只有少數(shù)研究使用另一種給藥方法,，即經(jīng)鼻、口服和腹膜內(nèi)給藥,。
表 4. 外泌體的藥物,、大分子和潛在靶向策略示例。
| 外泌體的藥物方法和給藥途徑 | ||||
| 藥物/大分子 | 加載效率和方法 | 起源 | 靶向細(xì)胞/組織 | 影響 |
| 紫杉醇 | 1.4%,；逆轉(zhuǎn)錄孵育,；5.3%；電穿孔,；28.3%,；輕度超聲處理 | RAW 264.7 細(xì)胞系 | Madin–Darby 犬腎 MDCK WT和 MDCK MDR1細(xì)胞，小鼠 Lewis 肺癌細(xì)胞亞系 (3LL-M27) | 多重耐藥細(xì)胞系的細(xì)胞毒性增加超過 50 倍,。 |
| 阿霉素 | 7.4%,；超聲處理和隨后的擠壓 | 4T1細(xì)胞系 | MCF-7細(xì)胞系 | 近紅外激光觸發(fā)的多柔比星從用 Fe 3 O 4修飾的外泌體中釋放。 |
| 阿霉素 | 6.5%,；超聲處理 | 雄性 KM 小鼠的小鼠骨髓 | 斑馬魚，攜帶 C6-Luc 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小鼠 | 快速血腦屏障穿越和腦積聚,。靶向：浸潤性腦腫瘤細(xì)胞,。 |
| hsa-miR148a-3p | 無損檢測；化學(xué)轉(zhuǎn)染（Lipofectamine 2000） | 牛奶 | HepG2,、Caco-2細(xì)胞系 | 具有成本效益的外泌體來源,。時(shí)間依賴性細(xì)胞摻入。 |
| 紫杉醇 | 8%,；逆轉(zhuǎn)錄孵育 | 牛奶 | 裸鼠肺腫瘤異種移植 | 腫瘤生長抑制,。與靜脈內(nèi)給藥相比，全身和免疫原性毒性較低 |
| 紫杉醇 | 14%,；藥物孵育細(xì)胞 | 來自臍帶的 MSC | A549,、SK-OV-3、MDA-hyb1細(xì)胞系,；NODscid 小鼠的 MDA-hyb1 乳腺腫瘤 | 與含有紫杉醇的外泌體相比,，使用高 1000 倍濃度的游離紫杉醇可減少癌癥的生長和轉(zhuǎn)移。 |
| 埃拉斯汀 | 3.2 毫克 erastin/毫克蛋白質(zhì),；超聲處理 | HFL-1細(xì)胞系 | MDA-MB-231細(xì)胞系 | 用于靶向遞送,、促進(jìn)鐵死亡、減少增殖和癌細(xì)胞遷移的葉酸標(biāo)記外泌體,。 |
| CRISPR/Cas9 質(zhì)粒 DNA | 來自 MSC 的外泌體的化學(xué)轉(zhuǎn)染（Exo-Fect™ 外泌體轉(zhuǎn)染試劑盒）,； | KPC689 | 成功破壞胰腺癌細(xì)胞中的Kras G12D致癌等位基因,。抑制增殖和腫瘤生長 | |
| CRISPR/Cas9 質(zhì)粒 DNA | 細(xì)胞 (HEK293T) 的化學(xué)轉(zhuǎn)染 (Lipofectamine 2000) 和從條件培養(yǎng)基中分離外泌體 | HEK293T細(xì)胞系 | 細(xì)胞系 | |
| PEI 基質(zhì)中靶向 KRAS 的 siRNA； | >90%,；與 PEI 基質(zhì)孵育,； | 牛初乳 | H1299、A549,、H522,、Panc-1、MiaPaCa-2細(xì)胞系,；體內(nèi) A549 異種移植模型 | 抑制腫瘤生長和 KRAS表達(dá),。在 p53-null H1299 細(xì)胞中誘導(dǎo) p53 的表達(dá)。 |
| 編碼 p53 的質(zhì)粒 DNA | <5%,；電穿孔,； | |||
| 35% 用 Exo-Fect™ 進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)染（約 35%） | ||||
| 阿霉素; 膽固醇修飾的 miRNA159 | 74.5–160.6 ng/μg 外泌體；在三乙胺溶液中孵育,；1.2% 的 miRNA,，5.3% 的膽固醇修飾的 miRNA | THP-1細(xì)胞系 | MDA-MB-231細(xì)胞系 | 外泌體的靶向特性，對(duì)癌細(xì)胞的協(xié)同治療作用,，抑制生長和運(yùn)動(dòng),。TCF-7 基因的沉默。 |
| 5-氟尿嘧啶,；miR-21抑制劑寡核苷酸 | 3.1%,；0.5%；電穿孔 | 293T細(xì)胞系 | HCT-116 SFR細(xì)胞系,；體內(nèi) BALB/c 裸鼠 | 成功共遞送,、細(xì)胞中 miR-21 的下調(diào)、周期停滯的誘導(dǎo),、增殖減少,、耐藥性逆轉(zhuǎn)、5-FU 細(xì)胞毒性增加,、體內(nèi)腫瘤生長減少 |
| miR-31-5p | 不適用,；電穿孔 | 牛奶 | HUVEC細(xì)胞系；體內(nèi) BALB/c 小鼠 | 體外細(xì)胞功能改善,，血管生成增強(qiáng),，糖尿病小鼠體內(nèi)傷口愈合 |
| CD47 和 SIRPα 抗體 | 通過 pH 敏感接頭與外泌體表面綴合 | RAW264.7細(xì)胞系 | RAW264.7細(xì)胞系，體內(nèi)BALB/C小鼠 | 靶向 CD47 表達(dá)細(xì)胞,，改善巨噬細(xì)胞吞噬作用,，外泌體重編程巨噬細(xì)胞抗癌活性 |
| galectin-9 siRNA，奧沙利鉑 | 半乳糖凝集素9,、13.17% 馬來酰亞胺-硫醇偶聯(lián)物的 13.17% N/A 電穿孔 | 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 | PANC-02細(xì)胞系,，體內(nèi)C57BL/6小鼠,，SD大鼠 | 顯著的抗癌活性，提高巨噬細(xì)胞腫瘤抑制活性,，增加細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞的募集 |
| 小檗堿 | 17.13%,，超聲處理 | 原代巨噬細(xì)胞 | C57BL/6J小鼠 | 巨噬細(xì)胞抗炎和抗凋亡 M2 表型的誘導(dǎo)，脊髓損傷后小鼠運(yùn)動(dòng)的改善 |
| Erastin,、Rose Bengal,、CD47 表面標(biāo)記的外泌體 | 60%、84% 的包封率,，超聲處理,；CD 47 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞 | HEK293T細(xì)胞系 | RAW264.7 Hepa1-6 細(xì)胞系，體內(nèi) C57BL/6 | 阻止外泌體吞噬作用,，激光照射后體內(nèi)和體外鐵死亡誘導(dǎo),，外泌體肝腎細(xì)胞毒性降低 |
| miR-138-5p | 慢病毒轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞 | 脂肪來源的干細(xì)胞 | T24，5637細(xì)胞系,，體內(nèi)BALB/C裸鼠 | 膀胱癌細(xì)胞增殖,、遷移和侵襲減少，抑制體內(nèi)腫瘤生長 |
選擇外泌體作為給藥載體的主要優(yōu)勢在于它可以降低藥物濃度，能夠準(zhǔn)確到病灶部位有效提高效率并減少藥物的毒副作用,。盡管如此,，外泌體的載藥效率仍有提升空間。比如：在外泌體研究領(lǐng)域中,，由于不同供體細(xì)胞分離的外泌體特性也是不同的,，需要足夠了解與熟悉各種外泌體的 特性，了解外泌體的長期毒性,、免疫原性和安全性這也是外泌體藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計(jì)的重點(diǎn),。
蘇州阿爾法生物專注于生物實(shí)驗(yàn)室儀器和生物試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材行業(yè)14年,。所提供的納米粒度儀,、熒光顯微鏡等廣泛應(yīng)用于細(xì)胞外泌體研究領(lǐng)域,。另外，提供的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備包括發(fā)酵罐,、生物反應(yīng)器,、細(xì)胞培養(yǎng)搖床、恒溫恒濕培養(yǎng)箱,、PCR儀,、乳酸分析測定儀等也廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)。
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