環(huán)境因素

1．無菌環(huán)境

無毒和無菌是體外培養(yǎng)細胞的首要條件,。細胞在活體內,，解毒系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)可抵抗微生物或其他有害物質的入侵，但細胞在體外培養(yǎng)的過程中,，缺乏機體免疫系統(tǒng)的保護而喪失對微生物的防御能力和對有害物質的解毒能力,。為保證細胞能在體外環(huán)境中生長繁殖,，必須要確保無菌工作區(qū)域、良好的個人衛(wèi)生,、無菌試劑和培養(yǎng)基以及無菌操作,。

常見的微生物污染有支原體、細菌,、真菌,。支原體無致死毒性，可與細胞長期共存,，對細胞有潛在影響,，但體積小，不易鑒別,，可借助于地衣紅或Hoechst33342染色來進行檢測,。細菌增殖快，在短時間內即可大量擴增,，并產生毒素殺死細胞,。真菌的種類繁多，肉眼可見,，漂浮于培養(yǎng)液面上,，可呈絲狀、管狀或樹枝狀等,。

2.合適的溫度

一般哺乳類與禽類細胞在體外培養(yǎng)的適宜溫度是37～38℃,，不適宜的環(huán)境溫度會影響細胞的生長。細胞對低溫的耐受能力要強于對高溫的耐受能力,，在低溫下,，細胞的代謝活力及核分裂能力降低。若溫度不低于0℃,，雖然細胞代謝受到影響,，但無損傷作用；25～35℃時,，細胞以緩慢的速度生長,；但若被置于40℃數(shù)小時，則不僅不利于細胞生存,、生長,，甚至可導致其死亡。

3.適宜的滲透壓

高滲溶液或低滲溶液會引起細胞發(fā)生褶皺,、腫脹,、破裂,。因此,，滲透壓是體外培養(yǎng)細胞的重要條件之一,。多數(shù)體外培養(yǎng)的細胞對滲透壓都有一定的耐受能力，實際應用中,，260～320mmol/L的滲透壓可適用于大多數(shù)細胞,。

4．氣體環(huán)境與pH

細胞的體外培養(yǎng)需要理想的氣體環(huán)境，氧氣,、二氧化碳是細胞生存的必要條件,。氧氣參與細胞的三羧酸循環(huán)，為細胞生存,、代謝與合成提供能量,；二氧化碳既是細胞的代謝產物，是細胞生長的必需成分,，又與維持培養(yǎng)液的pH有關,。大多數(shù)細胞適宜的pH范圍往往是7.2～7.4。在開放式培養(yǎng)中,，以5%的二氧化碳氣體比例為宜,。

營養(yǎng)條件

1．培養(yǎng)基

細胞培養(yǎng)基包含細胞生長所需的各種營養(yǎng)物質，包括碳水化合物,、氨基酸,、無機鹽、維生素等,。針對不同細胞的營養(yǎng)需求,，有多種合成培養(yǎng)基可供選擇，如EBSS,、Eagle,、MEM、RPMll640,、DMEM等,。

2．其他添加成分

在各種合成培養(yǎng)基提供基礎營養(yǎng)物質之外，還需根據(jù)不同細胞和不同的培養(yǎng)目的添加其他成分,，如血清,、因子等。

血清提供的是細胞外基質,、生長因子和轉鐵蛋白等重要物質,，常用的是胎牛血清。要根據(jù)不同的細胞和不同的研究目的決定添加血清的比例,。10%～20%的血清能維持細胞較快的生長增殖速度,，稱為生長培養(yǎng)液；為維持細胞緩慢生長或不死,，添加2%～5%的血清即可,，稱為維持培養(yǎng)液,。但血清中也存在有害于細胞生長和繁殖的物質，如補體,、免疫球蛋白和一些生長抑制因子,；成分不明確，影響對結果的分析,；不同動物,、不同批次的血清活性差別較大，影響培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性,。

谷氨酰胺是細胞生長重要的氮源,，在細胞生長代謝過程中起重要作用，但由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解,，4℃下放置7天即可分解約50%,，故谷氨酰胺需在使用前添加。