超濾離心管,,備有四種材質(zhì)的超濾膜:聚醚砜,、三醋酸纖維素、再生纖維素和Hydrosart,可根據(jù)不同要求靈活選用
使用注意事項(xiàng):
(1)選擇合適的超濾管,。通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3,,比如目的蛋白分子量為35kDa,就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管,。若目的蛋白分子量為10kD左右,,則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說明書,,注意超濾膜對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同,。
(2)新買來的超濾是干燥的,使用前加入超純水,,水量過膜,,冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出,,即可加入蛋白液,,加入的多少,以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn),。操作要輕,,加入蛋白液前,超濾管需要插在冰上預(yù)冷,。
(3)平衡,。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快,,否則直接損壞超濾膜,。開始離心超濾(離心機(jī)預(yù)冷至4度)。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后,,有所不同,。離心機(jī)的加速度調(diào)至低檔,減小對(duì)膜的壓力,。注意,,一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后,方可離開離心機(jī),,否則離心機(jī)出問題時(shí),,無法第一時(shí)間處理。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整(角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直),。在實(shí)際使用中,,一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低,這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命,。
(4)當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí),,取50ul緩沖溶液,,加入10ul流穿,看有沒變藍(lán)色,,以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了,將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾,。要精確判斷是否漏管,,用5mgml的BSA離心10min,再取流穿,,跑蛋白膠或Bradford粗測(cè),,繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作,防止蛋白受熱),,直到所有濃縮液都加完為止,。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,導(dǎo)致堵管,。若發(fā)生沉淀,,要確定沉淀的具體原因,是蛋白濃度過高還是Buffer不合適,;前者可用多根超濾管同時(shí)超濾,,降低濃度的辦法解決,后者的方法是換不同的緩沖溶液,,直到蛋白不發(fā)生沉淀為止,。
(5)前面幾步用以濃縮蛋白,如果要換Buffer,,在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候,,輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾),再 濃縮至1ml左右,,連續(xù)三次,,最后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,一般不多于500ul,,也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況,。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,三次達(dá)到1000倍以上,,基本上可以達(dá)到換buffer的目的,。
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