1、凍存細(xì)胞的效果好壞要看細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)的存活率,。細(xì)胞凍存時(shí),，細(xì)胞內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生晶體，水凝固形成的高濃度溶質(zhì)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷,，所以在凍存過(guò)程中要盡可能降低晶體的產(chǎn)生,。為了提高復(fù)蘇存活率，可通過(guò)以下方法完成：

a.降溫的速度不能太快,，讓細(xì)胞內(nèi)的水分緩慢離開(kāi)細(xì)胞,；

b.在低溫環(huán)境下凍存細(xì)胞可以降低高濃度鹽對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的影響,；

c.凍存試劑要采用親水的低溫保護(hù)劑；

d.復(fù)蘇時(shí)的速度要快,，這樣可以減少細(xì)胞內(nèi)部冰晶溶解時(shí)產(chǎn)生的某些可溶性成分,。

2、凍存細(xì)胞是為了留種,，所以要選擇高濃度的細(xì)胞量進(jìn)行凍存,。正常情況下，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到1*105/ml時(shí)即可凍存,，具體是多少量主要根據(jù)個(gè)人觀察,。

3、二甲基亞砜（DMSO)因?yàn)榇┩讣?xì)胞的能力較強(qiáng),，因此作為常用的凍存劑,，也可以叫做細(xì)胞保護(hù)劑加入到細(xì)胞懸液中。網(wǎng)上有些分享說(shuō)道,，如果選用DMSO,，整個(gè)細(xì)胞懸液的制作過(guò)程都要在4℃環(huán)境下進(jìn)行。本人采用過(guò)這種方法凍存過(guò)A549和某一原代細(xì)胞,，發(fā)現(xiàn)A549復(fù)蘇存活率和正常凍存的過(guò)程相比并沒(méi)有明顯區(qū)別，而原代細(xì)胞的接種率確實(shí)有所上升,，可能是因?yàn)槭茿549細(xì)胞比較皮實(shí),，這種方法更適用于比較脆弱的細(xì)胞吧。

4,、凍存液比例一般是培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或5:4:1,；動(dòng)物種屬的原代細(xì)胞凍存液可采用的比例是培養(yǎng)基：血清：DMSO=0:9:1，即直接用血清重懸細(xì)胞再加入DMSO,，盡管如此,，原代細(xì)胞的復(fù)蘇成活率還是很低。

5,、有文獻(xiàn)表明,，細(xì)胞以l℃/min的速度冷凍存活率最髙，因?yàn)檫@一速度可以很好的控制細(xì)胞內(nèi)部晶體的產(chǎn)生,。我們實(shí)際操作不可能將速度控制的這么精確,，目前慣用的就是4℃30min、-20℃1h30min,、-80℃2h后轉(zhuǎn)入液氮中,。

6、正常情況下,，經(jīng)過(guò)-20℃1h30min這一步后,，凍存管內(nèi)的細(xì)胞已經(jīng)處于凝固狀態(tài),，如果此時(shí)凍存管內(nèi)還是液體，很可能是DMSO或冰箱冷凍功能出現(xiàn)了問(wèn)題,。如若遇到這種情況,，不能因?yàn)闀r(shí)間到了，就把把液體狀態(tài)的凍存管放置到液氮中,，可以適當(dāng)延長(zhǎng)在-20℃環(huán)境下的冷凍時(shí)間30-60分鐘,，直至凍存液凝固后再放到液氮中。

7,、凍存記錄要表明細(xì)胞的種類,、凍存之前的狀態(tài)和大致數(shù)量、凍存時(shí)間和操作者,。

8,、液氮內(nèi)的細(xì)胞凍存最長(zhǎng)時(shí)間不要超過(guò)半年，凍存在液氮中的細(xì)胞應(yīng)一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行更替,。一個(gè)細(xì)胞系在培養(yǎng)一個(gè)月后,，可復(fù)蘇一管新的細(xì)胞確保其質(zhì)量沒(méi)有發(fā)生太大變化，傳代幾次后,，再凍存留種,。

9、細(xì)胞復(fù)蘇時(shí),，為保證獲得較高的存活率和接種率,，應(yīng)盡可能的快速完成復(fù)蘇，以避免在升溫過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)部晶體的產(chǎn)生,。書面介紹的復(fù)蘇溫度是37℃-42℃,，但是本人在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)40℃環(huán)境下復(fù)蘇。

10,、復(fù)蘇時(shí)的凍存管一定要密封好,，以免管內(nèi)外溫度和壓力不同導(dǎo)致凍存管炸裂。

11,、復(fù)蘇時(shí)使用的培養(yǎng)基和凍存時(shí)使用的培養(yǎng)基中的血清盡量保證同一批次,。

12、DMSO快速稀釋會(huì)對(duì)細(xì)胞造成滲透性損傷,，使存活率下降50%,。對(duì)于DMSO凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后應(yīng)緩慢稀釋成細(xì)胞懸液：

1.凍存液：培養(yǎng)基=1:1稀釋成細(xì)胞懸液后離心,，然后重懸至培養(yǎng)皿中培養(yǎng),，隔天換液。

2.凍存液：培養(yǎng)基=1:10稀釋成細(xì)胞懸液，不用離心,，直接放置到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2-4小時(shí)后,，換液。上述兩種方法都是比較常用的細(xì)胞復(fù)蘇方法,，后者更適用于原代細(xì)胞或比較難養(yǎng)的細(xì)胞,。