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聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,，它可看作是生物體外的特殊DNA復制,，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加,。目前,，PCR成為分子生物學研究的一部分,。實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技術,，是指在PCR反應體系中加入熒光基團,，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,，最后通過標準曲線對模板進行定量分析的方法,。該項技術可以對DNA、RNA樣品進行相對定量,、絕對定量和定性分析,，提高了普通PCR技術的特異性和準確性，被廣泛應用于基礎研究,、疾病診斷,、農(nóng)業(yè)檢測和法醫(yī)調(diào)查等領域。
一,、常規(guī)PCR
利用DNA分子會在體外95°高溫時會發(fā)生變性解旋變成單鏈,，然后降溫到60°C左右時引物會與單鏈DNA按堿基互補配對原則結(jié)合，接著再升高溫度到72°C左右,，即DNA聚合酶最適反應溫度,，DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成相應的互補鏈，如此循環(huán)往復以達到DNA分子擴增的目的,，常規(guī)PCR技術無法實現(xiàn)精確定量,。
二、實時熒光定量PCR
如要對DNA,、RNA樣品進行精確定量研究,，就需要采用實時熒光定量PCR，根據(jù)檢測實時熒光PCR產(chǎn)物的方式不同,，實時熒光定量PCR主要有DNA結(jié)合染料法,、基于探針的化學法、淬滅染料引物法等類型,。
1.DNA結(jié)合染料法
原理：應用一種帶有熒光的,、非特異的DNA結(jié)合染料檢測PCR過程中積累的擴增產(chǎn)物,。
應用于核算定量和基因表達驗證。
優(yōu)缺點：它們的優(yōu)點是可以對任何雙鏈DNA進行定量,，不需要探針,，具有相對高的靈敏度和可靠性，并且成本低,，簡單易用,，缺點是它們能在反應中結(jié)合所有的DNA雙鏈，其中包括在PCR過程中產(chǎn)生的引物二聚體或其他非特異產(chǎn)物,。
染料法一般使用的是SYBR Green I染料,，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料，不會與單鏈DNA結(jié)合,，并且在游離狀態(tài)下幾乎無熒光,，只有與雙鏈DNA結(jié)合才會發(fā)出熒光，因此將PCR擴增產(chǎn)生的雙鏈DNA數(shù)量與熒光強度直接關聯(lián),，產(chǎn)生實時監(jiān)測的效果。
2.基于探針的化學法
原理：應用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產(chǎn)物,；依賴熒光能量共振傳遞檢測特異性擴增產(chǎn)物,。
應用于核酸定量、基因表達驗證,、等位基因鑒別,、SNP分型、病原體和病毒檢測,、多重PCR,。
優(yōu)缺點：探針法的鑒別能力遠遠大于DNA結(jié)合染料法，因為它們只與目的產(chǎn)物結(jié)合,，從不與引物二聚體或其他非特異產(chǎn)物結(jié)合,，缺點是它的合成價格高。
探針法中常用的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針,，熒光基團連接在探針的5’末端,，而淬滅基團則在3’末端，PCR擴增時在加入引物的同時加入探針,，探針完整時,，熒光信號被淬滅基團吸收，PCR擴增時,，5’→3’外切酶活性將探針酶切降解,，使熒光基團和淬滅基團分離，從而檢測器可以接收到熒光信號,。
3.淬滅染料引物法
原理：采用熒光標記引物擴增,，從而使熒光標記基團直接摻入PCR擴增產(chǎn)物中,，依賴熒光能量共振傳遞。
應用于核酸定量,、基因表達驗證,、等位基因鑒別、SNP分型,、病原體和病毒檢測,、多重PCR
優(yōu)缺點：探針和目標片段的特異性結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，因此減少了背景熒光和假陽性,，還可進行多重PCR擴增,，缺點是原料成本價格高
三、實時熒光PCR儀
實時熒光PCR系統(tǒng)包括熱循環(huán)儀,，用于熒光激發(fā)的光學系統(tǒng)以及用于收集熒光數(shù)據(jù)和管理分析的計算機軟件,，數(shù)據(jù)通過實時分析軟件以圖表的形式顯示。
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