免疫組化原理,、流程及結(jié)果分析

免疫組化原理
免疫組化染色是用一抗與被檢測組織中目的蛋白抗原結(jié)合,，然后用HRP等標(biāo)記的二抗與一抗進(jìn)行結(jié)合，最后通過與DAB顯色劑反應(yīng),，進(jìn)而確認(rèn)所要檢測蛋白抗原的定位,、半定量等目的。
免疫組化更多的意義在于查看目的蛋白的定位,。定量一般用western來實(shí)現(xiàn),。

免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認(rèn)不同細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；而后者能夠針對特異性細(xì)胞標(biāo)志物來檢測特異性細(xì)胞的改變（數(shù)量）,、也可檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)位,，組織中一些特異性蛋白的表達(dá)的量改變（通過圖像分析系統(tǒng)分析顏色深淺、分布的面積等綜合分析）,。
通俗的講,，HE僅僅是看大體病理改變，比如組織壞死,，比如炎性滲出,。免疫組化，看你的目的蛋白的表達(dá)情況,。

免疫組化和HE染色的對比
DAB和HE一樣也是一種染色劑,，HE染色相對簡單，能分辨出細(xì)胞中的嗜酸嗜堿性物質(zhì),；DAB染色全稱應(yīng)該叫做免疫組化DAB染色,，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)后，DAB(二氨基聯(lián)苯胺)染色劑能將辣根過氧化物酶染成棕色,。

常用的免疫組化染色方法:
組化用HRP的話,，信號(hào)不夠強(qiáng),。通常用生物素標(biāo)記HRP來增強(qiáng)信號(hào)。
1,、ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法）
ABC法是利用卵白素與生物素*的高度親和力特性,，與生物素化二抗結(jié)合，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復(fù)合物,，最后DAB顯色,。
復(fù)合物配制：先將生物素與酶結(jié)合，形成生物素化HRP,，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合,，形成卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物。
2,、SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過氧化物酶復(fù)合物）
本身沒有連接生物素,，但有兩個(gè)生物素親和力ji高的結(jié)合位點(diǎn)，可以與二抗上的生物素結(jié)合,，敏感性高,，復(fù)合物不需要使用前混合，更為簡便,。
3、PAP法
4,、直接法

樣本制備


免疫組化結(jié)果分析
免疫組化結(jié)果的判斷原則：
1,、必須設(shè)陽性對照和陰性對照。
2,、 抗原表達(dá)必須在特定部位,。
3、 陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá),。

免疫組化染色實(shí)驗(yàn)組與對照組結(jié)果分析表 

從表可以看出只有6,、7實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義。1-5均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定Ab的特異性或IHC技術(shù)操作存在錯(cuò)誤等而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失去意義,，必須重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換用Ab,。

染色失敗的幾種情況及原因:
1、所染的全部切片均為陰性結(jié)果,，包括陽性對照在內(nèi),。
2、所有切片均呈陽性反應(yīng),。
3,、所有切片背景過深。
4,、陽性對照染色良好,，檢測的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng),。

所有切片呈陽性反應(yīng)，其原因:
1,、切片在染色過程中抗體過濃,，或干片了。
2,、緩沖液配置中未加氯化納和PH值不準(zhǔn)確,， 洗滌不徹di。
3,、使用已變色的呈色底物溶液,，或呈色反 應(yīng)時(shí)間過長。
4,、抗體溫育的時(shí)間過長,。
5、H2O2濃度過高,，呈色速度過快且粘附劑太厚,。

所有切片背景過深，其原因:
1,、內(nèi)源性過氧化酶沒有wan全阻斷,。
2、切片或涂片過厚,。
3,、漂洗不夠。
4,、底物呈色反應(yīng)過久,。
5、蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血,。
6,、使用全血清抗體稀釋不夠。

陽性對照染色良好,，檢測的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng),。
最常見的原因:標(biāo)本固定和處理不當(dāng)。

注意事項(xiàng)：
1,、蘇木素復(fù)染時(shí)間需要摸索,，尤其要考慮陽性染色的位置。
2,、切片脫蠟和水化要充分,；加反應(yīng)液時(shí)要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液,，但又防止干片,。
3,、以下原因可能導(dǎo)致片子著色不均勻：
①脫蠟不充分?？梢?0℃烤20min,，立即放入新鮮的二甲苯中。
②水化不全,。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇,。
③抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑,。④抗體孵育時(shí),，切片放傾斜。
⑤抗體孵育后PBS沖洗不充分,。
⑥制片厚薄不均勻等問題,。
⑦染片盒不平，切片傾斜,。
4,、一抗的清洗:
1、單獨(dú)沖洗,，防止交叉反應(yīng)造成污染,。
2、溫柔沖洗,，防止切片的脫落,，推薦用浸洗方式。
3,、沖洗的時(shí)間要足夠,，才能徹di洗去 結(jié)合的物質(zhì),。
5,、PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用：
1、建議PH在7.4-7.6濃度是0.01 M,。
2,、中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利 于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解,；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成,，而高離子強(qiáng)度則有利 于分解。
6,、拍照：
1,、有條件的話應(yīng)該立即拍照，若不能及時(shí)拍照,，也要封好片和用指甲油封固,，保持避光和濕度,。