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我們經(jīng)常遇到過這個問題：自己養(yǎng)的細胞開始長的還挺好的，可是凍存之后復蘇會發(fā)現(xiàn)細胞狀態(tài)不好甚至復蘇不起來,。出現(xiàn)這種問題很有可能就是你的凍存環(huán)節(jié)出了問題,。
當細胞冷到零度以下時，細胞器脫水,，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,，并在細胞內(nèi)形成冰晶，冰晶的大小對細胞有影響是不同的,，大冰晶容易造成細胞膜,、細胞器的損傷和破裂，因此就會造成我們復蘇出來的細胞存活率,、狀態(tài)等與凍存前的狀態(tài)相差甚遠,。那么我們要怎么解決這些問題呢？
首先我們在凍存的過程中要減少冰晶的形成,，尤其是大冰晶的形成：緩慢凍存細胞,，可使細胞內(nèi)避免產(chǎn)生大的冰晶。
那么我們該怎樣凍存細胞呢,？
一,、慢凍細胞
1、常規(guī)程序：
使用程序降溫盒
當溫度在-25℃以上時,，1-2℃/min,。
當溫度在-25℃以下時，5-10℃/min,。
當溫度達到-100℃時,，可迅速轉(zhuǎn)入液氮中。
2,、簡易程序：
冷凍管管口朝上,，放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩,，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口,，按每分鐘下降1-2℃的速度，在40min內(nèi)降至液氮表面過夜,，次晨投入液氮中,。
3、傳統(tǒng)程序：
冷凍管置于4℃10min,，-20℃30min,，-80℃16-18h（或隔夜），液氮長期儲存,。
二,、低溫保護劑
常用的低溫保護劑是DMSO,，它是一種滲透保護劑，可迅速透入細胞,，提高細胞膜對水的通透性,，降低冰點，延緩凍結過程,，能使細胞內(nèi)水分在凍結前透出細胞外,，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶,，從而減少冰晶對細胞的損傷,。
三,、細胞凍存方法
1,、預先配制凍存液：
凍存液比例多種，根據(jù)細胞的特性進行調(diào)整凍存液的比例：
5%—10%DMSO+20%—90%血清+0%—70%基礎培養(yǎng)液,；
2,、取對數(shù)生長期的細胞，去除舊培養(yǎng)液,，用PBS清洗1-2次,；去掉培養(yǎng)瓶里的殘余血清；
3,、加入適量胰酶（濃度一般為0.25%）,，使胰酶覆蓋整個瓶，放入培養(yǎng)箱消化,；
4,、細胞消化0.5-2min（具體時間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷），顯微鏡下觀察細胞,，細胞胞質(zhì)回縮,，細胞間不再連接成片，此時加入培養(yǎng)基終止消化,；
5,、用巴氏吸管輕輕吹打細胞，形成細胞懸液,，將細胞懸液1000r/min左右條件下離心3-5min,；
6、棄上清,，加入適量預先配制好的凍存液,，巴氏吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù),，調(diào)節(jié)凍存液中的細胞最終密度為5×106/ml～1×107/ml,；
7,、將細胞分裝入凍存管中，每管1-1.5ml,；
8,、凍存管標記細胞名稱，凍存時間,，操作者及細胞代數(shù)信息,。
對于懸浮細胞凍存，則直接收集離心細胞,，除去胰酶消化的步驟,，其他步驟相同。
注意事項
1,、需凍存保種的細胞應在生長良好且存活率高,，其密度約為80-90％的狀態(tài)。細胞凍存前應保證細胞的活力好,，無污染,。
2、在細胞凍存過程中,，所結的冰晶對細胞傷害較大,，所以過程一定要慢。凍存或者復蘇最好用新配制的培養(yǎng)液,。
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