液相色譜的保養(yǎng)小技巧

　　液相色譜組成部分：流動相溶劑瓶→高壓泵→進樣器→色譜柱→檢測器→廢液。

　　我們按照此順序來一一說明如何做保養(yǎng)?

　　01

　　流動相溶劑瓶的保養(yǎng)

　　溶劑瓶是流動相的起點,，通常是盛放水相溶液或是有機相溶液,。

　　1. 水相溶液 對于水相溶液來說,，首要的問題是防止污染,。對于溶劑瓶我們要做的非常重要的工作就是勤換流動相，常換常新,。

　　2. 有機相溶液 對于有機相溶液,，可以不用擔(dān)心細(xì)菌繁殖的問題。但是有機相容易發(fā)生聚合,，特別是乙腈在適宜的光照條件下極易發(fā)生聚合,，瓶子里就會出現(xiàn)一些絮狀的聚合沉淀物。為了防止聚合過程的發(fā)生,，裝乙腈時要用棕色的溶劑瓶,，避免陽光直射，更換乙腈時應(yīng)當(dāng)棄去瓶底剩余的溶液,。

　　3. 清洗過濾 溶劑瓶里的過濾頭,，其作用是為了防止溶液瓶中的顆粒雜質(zhì)進入到儀器的流路系統(tǒng)中，它的材質(zhì)通常分為玻璃燒結(jié)石英和不銹鋼,，如果不慎堵塞會造成流動相吸液不暢,，因此必須進行清洗，玻璃材質(zhì)的通常是用稀硝酸泡,，而不銹鋼材質(zhì)的可以直接進行超聲清洗,。

　　02

　　高壓泵的保養(yǎng)

　　泵是液相色譜的核心，泵將流動相從溶劑瓶輸送到液相流路系統(tǒng)中,，并要在高壓下保持流量和壓力的穩(wěn)定,。狀態(tài)正常的高壓泵是液相色譜準(zhǔn)確分析的基礎(chǔ)，所以平日一定要重視對泵的維護。

　　1. 泵壓力波動 很多情況下,，泵的問題反映在壓力上,，壓力波動又是常見的一類問題。通常我們可以通過重新清洗流路和再次脫氣流動相加以解決,。

　　2. 過濾白頭保養(yǎng) 在泵的維護里還有一項常做的工作就是更換清洗閥上的過濾白頭,，通常判斷的標(biāo)準(zhǔn)是純水以5 mL/min流速清洗的時候，如果壓力超過1 MPa則考慮更換,。

　　03

　　進樣器的保養(yǎng)

　　進樣器分手動和自動兩大類,，雖然兩者工作模式不同，但使用的要點是基本一致的,。

　　1. 防止交叉污染 自動進樣器常見的問題是交叉污染,，交叉污染產(chǎn)生的原因很直接，樣品殘留在進樣針內(nèi)外表面,，并隨下一次進樣進入色譜系統(tǒng),。要解決交叉污染，主要靠清洗,。

　　2. 精細(xì)操作 手動進樣器的操作要點大致相同,，應(yīng)使用液相色譜LC專用進樣針，進樣時插針應(yīng)插到底,，不使用時將針頭留在進樣器內(nèi),，使用前后都要及時清洗。

　　04

　　色譜柱的保養(yǎng)

　　色譜柱是化合物分離的關(guān)鍵,。保養(yǎng)良好的色譜柱具有更長的使用壽命,，且儀器基線平穩(wěn)。

　　1. 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動 溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料,，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行,，在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩(如前所述)。

　　2. 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成 特別是反相色譜中,，不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?/p>

　　3. 色譜柱反沖 納譜分析小分子分離液相色譜柱ChromCore系列和EcoPak系列色譜柱可以反沖;納譜分析手性色譜柱UniChiral系列色譜柱可以反沖，反沖可以除去留在柱頭的雜質(zhì),。但是納譜分析生物大分子液相色譜柱BioCore系列色譜柱不要反沖,，否則反沖會迅速降低柱效。

　　4. 選擇使用適宜的流動相(尤其是pH)以避免固定相被破壞,。

　　5. 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi) 需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱,。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換,。

　　6. 經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱,，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì) 在進行清洗時,，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,，即常規(guī)分析需要50~75 ml,。

　　反相柱清洗再生程序：

　　第一步：50%去離子水/50%甲醇或乙腈(5倍柱體積)

　　第二步：80%去離子水/20%甲醇或乙腈(5倍柱體積)

　　第三步：80%(含0.1%EDTA水溶液)/20%甲醇或乙腈(10倍柱體積)

　　第四步：80%去離子水/20%甲醇或乙腈(5倍柱體積)

　　第五步：100%甲醇或乙腈(5倍柱體積)

　　第六步：100%異丙醇(10倍柱體積)

　　第七步：100%甲醇或乙腈(5倍柱體積)

　　正相柱/HILIC色譜柱清洗再生程序：

　　第一步：50% 0.1 M醋酸銨，pH5/50%乙腈(5倍柱體積)

　　第二步：100% 0.1 M醋酸銨,，pH5(5倍柱體積)

　　第三步：50% 0.1 M醋酸銨,，pH5/50%乙腈(5倍柱體積)

　　第四步：100%乙腈(10倍柱體積)

　　第五步：100%異丙醇(10倍柱體積)

　　第六步：100%乙腈(5倍柱體積)

　　第七步：使用前用20倍柱體積的流動相平衡色譜柱

　　陽離子交換柱清洗再生程序：

　　第一步：0.1% 乙酸(5倍柱體積)

　　第二步：0.3M磷酸鹽緩沖液，含0.1% 乙二胺四乙酸(pH7,，至少20倍柱體積)

　　第三步：0.1% 乙酸(10倍柱體積)

　　第四步：乙腈(5倍柱體積)

　　第五步：異丙醇(至少20倍柱體積)

　　第六步：乙腈(5倍柱體積,，封存)

　　陰離子交換柱清洗再生程序：

　　第一步：0.1% 乙酸(5倍柱體積)

　　第二步：0.3M磷酸鹽緩沖液，含0.1% 乙二胺四乙酸(pH7,，至少20倍柱體積)

　　第三步：0.1% 乙酸(10倍柱體積)

　　第四步：乙腈(5倍柱體積)

　　第五步：異丙醇(至少20倍柱體積)

　　第六步：乙腈(5倍柱體積,，封存)

　　7. 保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊,，防止溶劑揮發(fā)干燥,。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過晚上或更長時間。

　　8. 色譜柱使用過程中,，如果壓力升高,，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗;另一種可能是大分子進入柱內(nèi),，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,，死體積增大,。

　　在后兩種情況發(fā)生時，小心擰開柱接頭,，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2 mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內(nèi)填料整平,。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的固定相(與柱內(nèi)相同)填滿色譜柱，壓平,，再擰緊柱接頭,。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平,。

　　柱子失效通常是柱端部分,，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5~30 mm)，可以起到保護,、延長柱壽命的作用,。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的,。

　　通常以硅膠為基質(zhì)的色譜柱,，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用,。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質(zhì)保留于柱頂,。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷,，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復(fù),。

　　每次工作完后,，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡,。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動相時,，使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟,、氯,、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸,。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用,，應(yīng)每隔4~5天開機沖洗15分鐘。

　　05

　　檢測器的保養(yǎng)

　　1. 光源部分

　　檢測器中非常重要的部件是光源,，光源對發(fā)射能量有要求,，一旦能量衰減到一定程度，就會出現(xiàn)基線噪聲變大,，靈敏度降低等一系列影響使用的問題,，因此光源是一個消耗品。通常紫外燈的壽命是2000 h,，當(dāng)?shù)竭_這個時限的時候,，我們就要特別關(guān)注燈的能量狀況，可以通過儀器維護軟件中自帶的“燈能量測試”功能來判斷,，測試的結(jié)果會分別評估低,、中、高三個波長段的能量,，一旦某個波長段的測試結(jié)果顯示失敗,，就表示需要更換燈。

　　2. 檢測池

　　檢測器中另一個重要部件是檢測池,，也叫流通池,。通常大家關(guān)心的一個問題是檢測池被堵掉，因為檢測池通常不是很耐壓,，所以一旦被堵就很可能造成損壞,。事實上檢測池通常不太容易被堵，原因是幾乎所有的顆粒雜質(zhì)都會被色譜柱攔下了,，所以堵塞檢測器的東西基本都不是來自樣品的,，很可能是后來“產(chǎn)生”的,，比如含鹽流動相殘留在檢測池中導(dǎo)致鹽析出。

　　06

　　廢液的處置

　　液相色譜儀LC的廢液大部分含有有機溶劑,，會對人體產(chǎn)生一定的危害,，對環(huán)境也會產(chǎn)生污染，嚴(yán)禁隨意傾倒,，應(yīng)及時處理,。目前，國內(nèi)大部分實驗室是將廢液送到專門的廢液處理站集中進行無害化處理,。