蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Western Blot）的基本流程和步驟

本文摘要
蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（免疫印跡實驗）又稱為Western Blot,。它是分子生物學(xué),、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法,。Western Blot主要用于檢測或分析蛋白，應(yīng)用領(lǐng)域集中在基因表達(dá)研究,、抗體活性檢測和疾病診斷等,。

01  蛋白質(zhì)印跡基本流程圖
 
02 western blot步驟
樣品準(zhǔn)備：

• Tanon 連續(xù)梯度預(yù)制膠（4-20% 10 孔/15 孔/17 孔）；  （4-12% 10 孔/15 孔/17 孔）

• Tanon Mops/MES 電泳緩沖液（粉劑）

• Tanon 預(yù)染蛋白 Marker

• Tanon 4×LDS Loading Buffer

• Tanon 快速蛋白染液

• 預(yù)制膠規(guī)格的選擇

 
    
在不使用預(yù)制膠的情況下,，需要自行配置適合蛋白電泳SDS膠,，采取自制膠的方法從加入緩沖液到制膠完成這一過程大概需要花費(fèi)將近1個小時。并且由于配比過程中的認(rèn)為誤差容易產(chǎn)生濃度不均一,，穩(wěn)定性差,，已出現(xiàn)外八型,、笑臉型等條帶,。采用天能系列預(yù)制膠具有較高的穩(wěn)定性和均一性，使蛋白電泳條帶更清晰銳利,，使得條帶更加均勻,。還有重要的一點(diǎn)就是可以免去制膠的時間，大大提升了實驗效率,。
 
蛋白轉(zhuǎn)印使用天能VE-586轉(zhuǎn)移電泳槽主要優(yōu)勢在于:它可以在不埋冰的情況完成的蛋白電泳,，如果配合快速轉(zhuǎn)膜液,，整個電泳過程只需不到30分鐘，可同時轉(zhuǎn)印4塊膠,，操作方法也比較簡便,。在縮短轉(zhuǎn)印時間的同時，實現(xiàn)了蛋白樣品的高效轉(zhuǎn)印,。
 
03  蛋白電泳
目前常用的是SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）,，蛋白質(zhì)會根據(jù)分子量大小分開，分子量的蛋白會留在膠的下部,，分子量大的會在膠的頂部,。

 
04 轉(zhuǎn)膜
轉(zhuǎn)膜主要是將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，常用的是NC膜和PVDF（聚偏氟乙烯）,，由于膜與蛋白質(zhì)高度親和的能力,，所以更容易與蛋白結(jié)合。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,，可以使用蛋白預(yù)染Marker,，以方便判斷蛋白分子量大小。

蛋白預(yù)染的傳統(tǒng)方法是膜將置于脫色搖床上,，用1×麗春紅染液振蕩預(yù)染5min,。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。

蛋白轉(zhuǎn)印使用天能VE-586轉(zhuǎn)移電泳槽主要優(yōu)勢在于:它可以在不埋冰的情況完成的蛋白電泳,，如果配合快速轉(zhuǎn)膜液,，整個電泳過程只需不到30分鐘，可同時轉(zhuǎn)印4塊膠,，操作方法也比較簡便,。在縮短轉(zhuǎn)印時間的同時，實現(xiàn)了蛋白樣品的高效轉(zhuǎn)印,。 
05 封閉
轉(zhuǎn)印完成后,，為阻止抗體的非特異性結(jié)合，需要用脫脂牛奶或者牛血清蛋白（BSA）作為緩沖液來填充封閉空白結(jié)合位點(diǎn),。

加入二抗稀釋液（一般1:1000甚至1:10000用TBST稀釋）,，放在搖床上，室溫下孵育1h后,，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,，每次10min；再用TBS洗一次,，10min,，即可進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

注意：二抗孵育之后也要注意充分洗滌,，一般30min左右為宜,，如果洗膜不夠充分,，顯影時會造成雜色背景。
 
06 ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：
在工作臺上鋪一張保鮮膜,，將PVDF膜置于保鮮膜上,。將ECL的A和B兩種試劑在EP管內(nèi)等體積混合（注意吸完A試劑后吸B試劑前要更換槍頭），然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面,，反應(yīng)1~2min后,，將PVDF膜上多余的ECL發(fā)光液吸干，進(jìn)行固定,。

 
07凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照,，使用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。常用的凝膠成像儀有天能系列的T4600,，T5200等系列,。