NanoTemper | STING抑制劑片段篩選案例分享
干擾素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes, STING)在天然免疫中發(fā)揮重要作用,,當(dāng)細(xì)胞被病原體(如病毒)感染時(shí),,STING可以誘導(dǎo)I型干擾素和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,是靶向治療自身免疫疾病和癌癥的潛在靶標(biāo)蛋白,。近年STING相關(guān)研究火爆,,管線數(shù)量激增。目前quan球范圍內(nèi)在研的STING靶向藥物超過50種,。
今天給大家介紹的STING抑制劑片段篩選案例是由NanoTemper和藥明康德旗下的Crelux公司合作完成的,。研究人員生產(chǎn)純化了帶有His-tag的STING蛋白,隨后使用Prometheus蛋白穩(wěn)定性分析儀進(jìn)行緩沖液優(yōu)化并使用環(huán)二核苷酸cGAMP作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行Thermal shift assay,,快速驗(yàn)證了蛋白的結(jié)合活性,。案例回顧:差示掃描熒光法表征蛋白配體互作,不加染料的那種
接下來(lái)研究人員使用Dianthus完成了片段化合物庫(kù)單點(diǎn)篩選及親和力排序,。
在使用Dianthus進(jìn)行篩選時(shí),其中一個(gè)分子需要帶有熒光,。本實(shí)驗(yàn)中, 研究人員使用His-tag熒光標(biāo)記試劑盒對(duì)STING蛋白進(jìn)行了特異性標(biāo)記,,片段終濃度為500μM,結(jié)合緩沖液為50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM DTT, 0.005% TWEEN® 20, 4% DMSO,。
STING片段篩選流程
下圖為單點(diǎn)篩選結(jié)果,,2213個(gè)片段加上陽(yáng)性及DMSO對(duì)照(均重復(fù)一次)總共采集了5376個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),即14塊384孔板,。消耗590μg STING蛋白,上機(jī)檢測(cè)時(shí)間約8h(Dianthus 33分鐘即可完成一塊384孔板檢測(cè),,↓ 文末觀看Dianthus上機(jī)演示)。紫色線框中的黃色數(shù)據(jù)點(diǎn)為陽(yáng)性對(duì)照cGAMP,,213個(gè)陽(yáng)性化合物響應(yīng)值CV僅0.25%,,檢測(cè)重復(fù)性非常好。
最后將單點(diǎn)篩選結(jié)果中的162個(gè)hits(上圖藍(lán)色數(shù)據(jù)點(diǎn))進(jìn)行12個(gè)濃度點(diǎn)的梯度稀釋檢測(cè)親和力,。消耗STING蛋白190μg,,上機(jī)檢測(cè)時(shí)間約3小時(shí)。
苗頭化合物驗(yàn)證
基于片段的藥物發(fā)現(xiàn) (FBDD) 是藥物研發(fā)的主流方法之一,。但片段分子量低,,且與蛋白靶標(biāo)親和力低,,通常在μM-mM范圍,因此對(duì)篩選技術(shù)的靈敏度有較高的要求,。Dianthus基于光譜位移技術(shù)(Spectral shift)檢測(cè),,不依賴于分子量,可檢測(cè)pM-mM的親和力,。此外,,Dianthus檢測(cè)一個(gè)kd僅需1min,單孔上樣體積20μl,,是您親和力篩選項(xiàng)目的強(qiáng)大工具,!Dianthus產(chǎn)品介紹:全新Dianthus攜光譜位移技術(shù)橫空出世,1分鐘擊破親和力篩選難點(diǎn),!
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