長期以來,，內(nèi)皮功能障礙和炎癥一直被認(rèn)為是動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的最早事件,，因此是一個有價值的治療靶點,。振蕩剪切應(yīng)力（OSS）通過觸發(fā)信號分子的釋放來激活內(nèi)皮細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)，以響應(yīng)流量感應(yīng)受體的機械激活,。暴露于高剪切應(yīng)力和層流區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞通過釋放無數(shù)動脈粥樣硬化保護(hù)基因（包括Kruppel樣因子2（KLF2））而具有動脈粥樣硬化保護(hù)能力,。IL-8 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達(dá)驅(qū)動單核細(xì)胞募集到血管系統(tǒng)中的 OSS 區(qū)域，其中粘附分子包括血管粘附分子（VCAM）-1 和內(nèi)皮細(xì)胞選擇素（E-selectin）導(dǎo)致單核細(xì)胞和白細(xì)胞滾動并粘附在內(nèi)皮上,。

KLF2是一種重要的鋅指轉(zhuǎn)錄因子,，對動脈粥樣硬化產(chǎn)生具有保護(hù)作用。在層流剪切應(yīng)力誘導(dǎo)下,，KLF2下調(diào)VCAM-1和E-選擇素的表達(dá),，從而減弱單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。然而,，KLF2在暴露于OSS的動脈分支和其他區(qū)域表達(dá)降低,，這些區(qū)域長期以來一直被認(rèn)為容易發(fā)生動脈粥樣硬化病變。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員,，也密切參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化的發(fā)生,。

最近，G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）家族作為多種疾病的有價值的治療靶點受到重視。在GPCR家族的大約800個成員中,，GPR81,，也稱為羥基羧酸受體1（HCAR1），是一種選擇性乳酸敏感受體,，已知在多種細(xì)胞類型中表達(dá),，包括腦細(xì)胞、脂肪細(xì)胞,、各種癌細(xì)胞和視網(wǎng)膜等。GPR81已被證明在骨髓內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá),，據(jù)報道,，GPR81介導(dǎo)的乳酸信號通路可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。

在華中阜外醫(yī)院（河南省人民醫(yī)院心臟中心）團(tuán)隊的一項研究中,，探索了GPR81介導(dǎo)的乳酸信號通路在OSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥中的潛在作用,。

首先，實驗進(jìn)行了實時PCR和蛋白質(zhì)印跡分析,，以確定暴露于OSS對HUVECs中GPR81表達(dá)的影響,。如圖1 所示，持續(xù)暴露至 5 dyn/cm2 OSS以時間依賴性方式顯著降低HUVECs中GPR81的表達(dá),。在 24 小時時間點下,，GPR81 的表達(dá)在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上均降低了 50% 以上。

圖1   暴露于振蕩剪切應(yīng)力（OSS）抑制了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中的GPR81,。HUVECs用OSS處理（5 dyn/cm2） 8,、16 和 24 小時。

（a）實時熒光定量PCR顯示OSS在mRNA水平上降低了GPR81的表達(dá),。（b）蛋白質(zhì)印跡顯示OSS在蛋白質(zhì)水平上降低了GPR81的表達(dá),。

不同的流動模式在內(nèi)皮細(xì)胞中引發(fā)不同的生物反應(yīng)。經(jīng)歷OSS的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入促炎狀態(tài),，而暴露于生理高剪切力（HSS）的內(nèi)皮細(xì)胞則具有抗炎特性并表達(dá)動脈粥樣硬化保護(hù)分子,。通過將HUVECs暴露于OSS或HSS（15 dyn/cm2）中24小時，實驗進(jìn)一步研究了OSS和HSS對GPR81表達(dá)的調(diào)控是否不同,。結(jié)果表明,，HSS在mRNA和蛋白質(zhì)水平上顯著增加了GPR81的表達(dá)，這與OSS的效果相反,。這些數(shù)據(jù)表明,，剪切應(yīng)力具有直接增加或降低GPR81基礎(chǔ)表達(dá)水平的能力。

氧化應(yīng)激是內(nèi)皮功能障礙過程中的關(guān)鍵因素,。因此,，研究了乳酸（GPR81特異性激動劑）對OSS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響。如圖2所示，暴露于OSS使線粒體活性氧（ROS）的產(chǎn)生增加到大約四倍,。然而,，用乳酸處理將ROS的產(chǎn)生降低到僅約1.5倍基線水平，因此表明乳酸具有有效的抗氧化特性,。

圖2   用乳酸抑制振蕩剪切應(yīng)力（OSS）誘導(dǎo)的線粒體ROS生成,。HUVECs在存在或不存在7.5、15 mM乳酸24小時的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2）,。線粒體ROS通過用MitoSOX紅染色來測量,。

接下來，確定了乳酸介導(dǎo)的激活參與OSS誘導(dǎo)的幾種關(guān)鍵炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá),。結(jié)果表明,，OSS在mRNA和蛋白質(zhì)水平上觸發(fā)了IL-6、IL-8和MCP-1表達(dá)的顯著增加,。然而,，乳酸的存在導(dǎo)致這些分子的表達(dá)顯著降低。同時,，乳酸以劑量依賴性方式將OSS誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)從約5.2倍降低到僅1.8倍,。

為了確定乳酸對OSS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響，實驗研究了乳酸對VCAM-1和E-選擇素表達(dá)的影響,。如圖3所示,，實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果表明，OSS分別在mRNA水平,，特別是在蛋白質(zhì)水平上顯著增加了VCAM-1和E-selectin的表達(dá),。同時，兩劑乳酸的加入極大地抑制了OSS誘導(dǎo)的這兩種粘附分子的表達(dá),。為了確認(rèn)乳酸的這種潛在的抗單核細(xì)胞粘附能力,，進(jìn)行了實驗以確定暴露于OSS時附著在HUVECs上的人白血病細(xì)胞單核細(xì)胞U937的數(shù)量。結(jié)果表明,，OSS將附著的U937細(xì)胞的數(shù)量增加到大約3.3倍,，通過兩劑乳酸以劑量依賴性方式減少到僅2.1倍和1.5倍。

圖3   用乳酸抑制振蕩剪切應(yīng)力（OSS）誘導(dǎo)的VCAM-1和E-選擇素表達(dá),。

HUVECs在存在或不存在7.5,、15mM乳酸24小時的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2）。（a）通過實時PCR分析確定的VCAM-1和E-選擇素的mRNA水平,。（b） 通過蛋白質(zhì)印跡分析確定的 VCAM-1 和 E-選擇素的蛋白質(zhì)水平,。

最后，實驗研究了KLF2和ERK5通路在介導(dǎo)GPR81激活的這些保護(hù)作用中的參與,。結(jié)果表明,，暴露于OSS使動脈粥樣硬化保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子KLF2的表達(dá)降低了約65%,，通過使用乳酸激活GPR81，KLF2在mRNA和蛋白質(zhì)水平上以劑量依賴性的方式恢復(fù)到接近基線水平,。

為了確定ERK5通路在GPR81介導(dǎo)的KLF2表達(dá)恢復(fù)中的參與,，首先測量了暴露于OSS和兩劑乳酸時的磷酸化和總ERK5水平。如圖4 a所示,，OSS顯著降低了p-ERK5的水平,，而乳酸以劑量依賴性方式挽救了p-ERK5的水平。接下來,，使用特異性ERK5抑制劑XMD8-92來確認(rèn)GPR81對KLF2的拯救是通過ERK5介導(dǎo)的,。如圖4 b、c所示,，抑制ERK5在mRNA和蛋白質(zhì)水平上消除了乳酸介導(dǎo)的對KLF2表達(dá)的恢復(fù),，從而表明乳酸介導(dǎo)的GPR81激活對OSS誘導(dǎo)的KLF2表達(dá)抑制的保護(hù)作用取決于ERK5通路。

圖4   乳酸誘導(dǎo)的KLF2表達(dá)由ERK5介導(dǎo),。

（a）HUVECs在存在或不存在7.5、15mM乳酸24小時的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2）,，測量p-ERK5和總ERK5,。（b）HUVECs在存在或不存在15 mM乳酸24小時或特異性ERK5抑制劑XMD8-92（10 nM）的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2），測量KLF2的mRNA水平,。（c） HUVECs在存在或不存在15 mM乳酸24小時或特異性ERK5抑制劑XMD8-92（10 nM）的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2）,，測量KLF2的蛋白質(zhì)水平。

為了進(jìn)一步證實GPR81參與介導(dǎo)乳酸對HUVECs中OSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的保護(hù)作用,，用siGPR81轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。GPR81的成功敲低如圖5 a。重要的是,，發(fā)現(xiàn)敲低GPR81消除了乳酸對OSS誘導(dǎo)的VCAM-1和E-選擇素表達(dá)的抑制作用（圖5 b）,。GPR81的沉默也阻止了乳酸對OSS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞附著于HUVECs的抑制作用（圖5 c）。這些發(fā)現(xiàn)表明,，乳酸對OSS誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)皮功能障礙的抑制作用是由GPR81介導(dǎo)的,。

圖5   敲低GPR81消除了乳酸對內(nèi)皮功能障礙的抑制作用。

（a）蛋白質(zhì)印跡分析顯示GPR81成功敲低,。（b）通過蛋白質(zhì)印跡分析測量VCAM-1和E-選擇素的表達(dá),。（c）測定U937細(xì)胞與HUVEC的附著。

總之,，該研究結(jié)果證明了GPR81作為有效的動脈粥樣硬化保護(hù)受體的新作用,。GPR81在暴露于OSS的血管動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域中的特異性激活可以通過抑制內(nèi)皮炎癥和氧化應(yīng)激，抑制粘附分子的表達(dá)以及上調(diào)保護(hù)性KLF2轉(zhuǎn)錄因子的低表達(dá)來抑制動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化病變的發(fā)展,。

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