在生物治療藥物的生產(chǎn)過程中,,滴度測定用于測量發(fā)酵液中目標蛋白質(zhì)的濃度,。在以下兩種重要的情況下,需要進行準確的滴度測定,。第一種情況是在克隆選擇過程中,,僅選擇那些提供足量目標蛋白質(zhì)的轉染克隆,,因為并非所有克隆都同等有效。第二種情況是在發(fā)酵工藝的放大過程中監(jiān)測目標蛋白質(zhì)的濃度,。細胞培養(yǎng)基條件的優(yōu)化和最佳收獲時間的確定依靠準確的滴度測定,。
親和色譜法
對于單克隆抗體,最有效的滴度測定方法之一是親和色譜法,。親和色譜是一種利用特定蛋白之間(如抗原/抗體)高度特異性分子間相互作用的強大分離技術。安捷倫提供了幾種專門的親和產(chǎn)品,,包括用于對單克隆抗體 (mAb) 進行分離和定量的Biomonolith Protein A 和 Protein G 色譜柱,。
近年來,mAb 已成為可滿足多種疾病治療需求的主要生物制藥產(chǎn)品,。這些經(jīng)特別設計的抗體具有特定的基因構成,,能夠更好地以病原為靶標。在這些抗體的開發(fā)過程中,,Protein A 和 Protein G 分析型親和色譜柱可用于測定各種細胞培養(yǎng)上清液中的抗體滴度或濃度,,以選出高產(chǎn)量的克隆。
色譜柱選擇
Protein A 和 G 色譜柱對抗體均具有高親和性,,因此它們僅結合細胞培養(yǎng)上清液中的抗體,。然而,它們的選擇性各有不同,。例如,,Agilent Bio-Monolith Protein A 色譜柱對人 IgG1、IgG2 和 IgG4 亞型具有高親和力,,對 IgG3 沒有親和性,,而 Agilent Bio-Monolith Protein G 色譜柱對人 IgG1、IgG2,、IgG3 和 IgG4 亞型都具有高親和力,。IgG1 憑借其穩(wěn)定性(半衰期較長)、在血清中的豐度以及較少出現(xiàn)聚集,,成為最常用的生物治療藥物,。通常不使用 IgG3,因為它容易聚集且不太穩(wěn)定,。相反,,Protein G 色譜柱對人亞類單克隆抗體(例如 IgA 和 IgD)沒有親和性,但是 Protein A 色譜柱能夠與這些抗體結合(表 1),。這些色譜柱相互補充,,Protein G 對不與 Protein A 結合的 mAb 具有親和性,反之亦然(圖 1),。因此,,它們能夠實現(xiàn)目前作為生物治療藥物進行開發(fā)的各種 mAb 亞類和片段的滴度測定,。
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*Protein A 和 G 對不同抗體的相對親和性表示法:++++ = 強親和性,+++ = 中等親和性,,++ = 弱親和性,,+ = 微弱親和性,- = 無親和性,。
樣品前處理
親和色譜的樣品前處理方法與 HPLC 蛋白質(zhì)分析的樣品前處理方法類似,。進樣前需要極少的樣品前處理,以優(yōu)化色譜柱性能并延長色譜柱壽命,。
對樣品進行離心或過濾,,去除上清液或裂解液中的宿主細胞碎片和顆粒,以防止堵塞色譜柱,。
對于血清/血漿樣品,,最好去除樣品中的脂類。脂類將與色譜柱發(fā)生強結合,,導致色譜柱和儀器污染,。
快速分離方案
Agilent Bio-Monolith rProtein A(重組 Protein A)分析柱是 Bio-Monolith 和親和色譜家族的新成員。該色譜柱可用于高速分析單克隆抗體 (mAb) 滴度和小規(guī)模純化,,并可輕松集成到二維液相色譜等其他分析工作流程中,。本研究以最大流速測試了重組 Protein A 色譜柱,證明了一種色譜結合/洗脫法可用于測定 mAb 滴度,,該方法具有非常短的運行時間(1 分鐘),,適用于克隆篩選、工藝開發(fā)及優(yōu)化等高通量應用,。
此外,,本篇應用文集中還包含使用 Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC 色譜柱縮短定量分析人 IgG 的分析周期、使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色譜柱和 LC/MS 進行的細胞培養(yǎng)優(yōu)化等應用簡報供您查閱,。
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