單細胞測序在疾病診斷和細胞異質(zhì)性研究中發(fā)揮著重要作用,，單細胞測序已經(jīng)讓我們能以全新的方式理解細胞的生化過程,。然而目前的單細胞測序手段需要將細胞消化并裂解才能夠進行,，而細胞狀態(tài)在這一操作中不可避免的會發(fā)生改變,，因此很難掌握細胞真實的基因表達情況。近日,，來自中國科學院深圳先進技術(shù)研究院研究員陳萬澤以第一作者身份在國際期刊Nature上發(fā)表長文,，使用多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM創(chuàng)建了一種原位活細胞基因測序方法Live-Seq，這種方法能夠在不殺死細胞的情況下完成對細胞的測序工作。通過這種技術(shù)該團隊成功完成單細胞RNA基因測序,，并通過這種方法檢測到了細胞的基因表達和細胞周期狀態(tài)變化。下面本文就這項工作的具體內(nèi)容進行闡述,。

1. Live-Seq測序技術(shù)簡述

由于單個細胞的RNA總量僅有10 pg,。為了實現(xiàn)無損的單細胞測序，陳老師的團隊首先使用FluidFM對現(xiàn)有的scRNA-Seq單細胞測序的方法進行了優(yōu)化,。為了盡可能的接近Smart-Seq的測試條件,，團隊采用了首先將緩沖液吸入探針，然后再進行細胞提取的操作,。這樣可以確保所提取的RNA能夠第一時間與緩沖液混合,，從而避免RNA的降解。通過這一方法,，該團隊成功實現(xiàn)了IBA細胞的測序,，證明了這種方法的可行性（圖1）。

圖1. Live-Seq技術(shù)

a. Live-Seq技術(shù)的示意圖和代表圖片,，黑色箭頭指液體位置,；b. IBA細胞測序的質(zhì)量控制圖（n=10）。

2. Live-Seq技術(shù)分析細胞系和細胞狀態(tài)

為了證實Live-Seq的有效性,，陳老師團隊對多種細胞系進行了測序,，這其中包括IBA細胞、小鼠脂肪干細胞和祖細胞（ASPCs）以及脂多糖處理的RAW264.7細胞和Mock處理的RAW264.7細胞,。通過對這些細胞系進行測序發(fā)現(xiàn),，該方法能夠區(qū)分上述細胞系，并且在特征基因檢測中能夠找到每種細胞所對應(yīng)的特征基因,，證明了Live-Seq方法的有效性（圖2）,。

圖2. Live-Seq單細胞測序區(qū)分細胞型及細胞狀態(tài)

3. Live-Seq技術(shù)對細胞的活力基本沒有影響

Live-Seq技術(shù)的優(yōu)勢在于提取過程中不會破壞細胞。通過對提取前后的測序?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn),，提取組與空白組之間的團簇沒有顯著性差異,。并且通過對細胞形態(tài)的觀察中，發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)基本沒有改變,，并且多數(shù)細胞仍然能夠正常分裂（圖3）,。

圖3. Live-Seq對細胞活力的影響

a. 細胞實驗的示意圖；b. Live-Seq測序后不同時間點（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE圖,；

4. Live-Seq技術(shù)能夠記錄細胞下游分子表型事件

由于Live-Seq對細胞生理狀態(tài)影響小,，因此能夠監(jiān)測在細胞代謝過程中的基因變化。通過對比LPS處理的巨噬細胞周期實驗中發(fā)現(xiàn),，Live-Seq技術(shù)與對照組的細胞代謝水平相比沒有明顯變化,，因此這種方法測量的數(shù)據(jù)十分接近細胞代謝中基因表達的真實水平。通過測序?qū)Ρ萀PS處理與空白的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nfkbia與Tnf的表達非常相關(guān),。這一結(jié)果也驗證這種測序方法在檢測細胞下游表型時的優(yōu)勢,。

圖4. Live-Seq技術(shù)的單細胞縱向分析

5. Live-Seq技術(shù)對同一細胞多次測序

Live-Seq技術(shù)的無損性甚至能夠?qū)崿F(xiàn)對單個細胞的多次測序,。通過對單個細胞兩次提取后細胞活力變化的觀察中發(fā)現(xiàn)，細胞的活力即使在2次提取后仍沒有發(fā)生明顯的變化,，基因型分析也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的基因表型改變,。

圖5. Live-Seq對細胞的多次提取，連續(xù)測序的示意圖和代表圖像,；整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE圖,。

6. 總結(jié)

Live-Seq是一種十分具有前景的單細胞測序的新方法，得益于FluidFM技術(shù)的無損提取的優(yōu)勢,，Live-Seq技術(shù)除了能夠?qū)崿F(xiàn)傳統(tǒng)測序的功能外,，還降低了細胞的損傷，能夠提供更加原生和真實的測序信息,。這種特點甚至讓單細胞的基因表達動力學研究成為可能,。相信隨著這種技術(shù)自動化的提高，將為單細胞測序技術(shù)帶來更多可能,。

參考文獻：

[1] Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Pernille Yde Rainer, Christoph G. G?belein, Wouter Saelens, Vincent Gardeux, Amanda Klaeger, Riccardo Dainese, Magda Zachara, Tomaso Zambelli, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, Nature (2022); DOI: 10.1038/s41586-022-05046-9

相關(guān)產(chǎn)品：

1、多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)- FluidFM OMNIUM