小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7培養(yǎng)說明書

一、細胞培養(yǎng)條件

二、細胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿*培養(yǎng)液并封好瓶口是運輸細胞的最好辦法,。收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞瓶，消毒后放到超凈臺內(nèi)嚴格無菌操作,，將細胞瓶放入37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài)后再做處理,。顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張）,，前三天照片是重要售后依據(jù),，不提供照片默認收到狀態(tài)良好,。（注意密封培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時要將蓋子擰松，傳代后建議一瓶用原瓶的*培養(yǎng)基,，另外一瓶用自己配的*培養(yǎng)基，以便進行對比培養(yǎng)）

三,、細胞培養(yǎng)步驟

a、細胞傳代：如果未超過80%匯合度時,，將瓶裝的*培養(yǎng)液收集至離心管中,，留5ml*培養(yǎng)基,，放入37℃、5%CO₂孵箱培養(yǎng),；如果細胞密度超80%，即可進行傳代培養(yǎng),，傳代具體步驟如下：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上*培養(yǎng)基終止消化,。

3.輕輕吹打細胞，使之*脫落后吸出,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL*培養(yǎng)基重懸,。

4. 將細胞懸液按1：2的比例進行分瓶傳代（兩個T25瓶）,，補充新的*培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,，最后放入到37℃、5%CO₂的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

b、細胞凍存：

1,、細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次,；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察,，待細胞回縮變圓后加入5ml*培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，1000rpm離心 5min；

3,、 棄上清,，沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001）,，混勻后加入凍存管中。

4,、 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可,，如后期要將細胞轉(zhuǎn)入液氮罐中，則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中,。

C,、細胞復蘇：

1、從液氮中取出細胞凍存管（注意佩戴防護面具）,，快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結(jié)晶,，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁,；

2、將凍存管中的細胞移至含 5ml *培養(yǎng)基的15ml離心管中,，1000rpm離心5min；

3,、棄上清,，沉淀用5ml*培養(yǎng)基重懸，接種至T25培養(yǎng)瓶,，放于37℃,5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4,、第二天,，換用新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。

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四、注意事項：有些細胞比較特殊,，如貼壁不牢，在運輸過程中發(fā)生容易細胞脫落,，這是正?，F(xiàn)象。請將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,，1000rpm離心5min,，收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對比培養(yǎng)）,，沉淀加入胰酶1-2ml，輕輕吹打,，重懸,，消化1-2分鐘后,，加5ml*培養(yǎng)基終止反應。再離心,，棄上清,，加1-2ml*培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進行分瓶傳代（兩個T25）,，補充新的*培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

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五,、售后條款：

1）細胞出現(xiàn)問題,，可重發(fā)的情況有哪些？判定標準是什么,？

1. 細胞運輸途中遭遇的各種問題,，細胞丟失,、瓶身破損、培養(yǎng)液嚴重漏液等,，重發(fā),；

2. 細胞污染問題，請在收到產(chǎn)品48小時內(nèi),，給我們提出真實的實驗結(jié)果，核實后重發(fā),；

3. 常溫發(fā)貨的細胞靜置24小時后,，干冰凍存發(fā)貨的細胞復蘇后24小時后，絕大多數(shù)細胞未存活,，（需提供真實清晰的細胞狀態(tài)照片）,，重發(fā),；

4. 干冰凍存發(fā)貨的細胞復蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細胞靜置4小時候并且未開封,，出現(xiàn)污染，重發(fā),；

5. 細胞活性問題,，請在收到產(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果，用臺盼藍染色法鑒定細胞活力,，核實后予重發(fā),；

6. 細胞收到當天以及第2,3天請拍照，3天未告知的,，視為產(chǎn)品合格。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細胞前3天照片和細胞出現(xiàn)問題時照片以及細胞相關操作的詳細步驟的,，并跟技術(shù)人員溝通的,，由技術(shù)人員判定為我方責任的，重發(fā),。技術(shù)人員判定為雙方承擔責任的由雙方進行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費重發(fā),。

2）細胞出現(xiàn)問題，不予以重發(fā)的情況有哪些,？

1. 客戶造成細胞污染，不重發(fā),；

2. 客戶不正確操作致細胞狀態(tài)不好,，不重發(fā)；

3. 非本庫推薦細胞培養(yǎng)體系致的細胞狀態(tài)不好,，不重發(fā),；

4. 細胞狀態(tài)不好,，未提供細胞培養(yǎng)前3天照片的,，不重發(fā),；

5. 細胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理的，不重發(fā),；

6. 細胞收到2天內(nèi),，未告知，不重發(fā),；

7. 視具體情況而定,。 

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