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1,、配制含10%DMSO或甘油,、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；
2,、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗,。
3,、去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養(yǎng)皿表面）把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái),；
4,、離心1000rpm，5min,；
5,、去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml,；
6,、細(xì)胞分裝入凍存管中,，每管1～1.5ml,；
7、在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱,，凍存時(shí)間及操作者,；
8、凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/min,；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí),，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí),，則可迅速浸入液氮中,。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管,，移入液氮容器內(nèi),。
注意事項(xiàng)
1、從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞用于凍存,，最好為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液；
2,、將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí),，要做好防護(hù)工作，以免凍傷,；
3,、凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。
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