Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析,。

CCK-8 & MTT 方法比較

一,、原理：

CCK-8 是 MTT 的升級產(chǎn)品,，其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）,。

生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比,，與細胞毒性成反比，間接反映活細胞數(shù)量,。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

二,、用途：

用于細胞增殖測定,、細胞毒性測定,、藥物篩選,、抗腫瘤藥物敏感性測定,。

三、材料與儀器

【材料】細胞懸液

【試劑】 CCK8

【儀器,，耗材】96 孔板,，二氧化碳培養(yǎng)箱，酶標儀

四,、步驟：

1、取對數(shù)生長期的細胞制備細胞懸液,，細胞計數(shù)；

2,、根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)接種到 96 孔板中，每孔約 200 ul（2×10³-2×10⁴/孔）細胞懸液,，同樣的樣本可做 3-5 個重復，將 96 孔板在 37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24,48,72 h,；

3、設置空白對照組：不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照,，其他試驗步驟保持一致。細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4-8小時；

4,、加入20ul CCK8：由于每孔加入CCK8 量比較少,，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻,?；蛘咧苯优渲煤?10% CCK8 的培養(yǎng)基,，以換液的形式加入；

5,、培養(yǎng)1-4小時:細胞種類不同,，形成的Formazan的量也不一樣,。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng),，以確認最佳條件,。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）,；

6、測定 450 nm吸光度：建議采用雙波長進行測定,，檢測波長 450-490 nm,，參比波長600-650 nm。

五,、注意事項

1、當在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時,，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā),，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下,，最外一圈的孔加培養(yǎng)基或者PBS，不作為測定孔用,。避免邊緣效應,。    

2、用酶標儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡,，否則會干擾測定,，且要擦拭干凈樣品板,。

3、細胞種板數(shù)不易過多,，否則細胞自身發(fā)生接觸抑制,，影響OD數(shù)值，較長培養(yǎng)時間建議每孔加入200μl培養(yǎng)基,。                                  

4.若暫時不測定OD值,，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下,。24 小時內(nèi)測定,，吸光度不會發(fā)生變化。        

5,、懸浮細胞由于染色比較困難,，一般需要增加細胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間,。

6、加入CCK-8 時,，如果細胞培養(yǎng)時間較長,，培養(yǎng)基顏色或 pH 值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基,。