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避免RNA降解的注意事項(xiàng)

1. 使用正確的細(xì)胞或組織儲存條件 

在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后,，應(yīng)該儲存在-80°C,，千萬不能解凍,。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍,，也會導(dǎo)致 RNA 的降解和損失,。瞬間凍結(jié)的組織應(yīng)該首先在超低溫條件下先研磨成粉,，然后置于裂解液中進(jìn)行勻漿。RNAfixer 使樣品儲存更為便利,。儲存在 RNAfixer 中的細(xì)胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長達(dá) 1 個星期,，在 4°C 可穩(wěn)定保存長達(dá)1 個月，或**保存在-20°C,。 

2. 消除環(huán)境 RNase 的污染 

為了得到完整的,、高品質(zhì) RNA，在整個 RNA 制備過程中,，當(dāng) RNA 離開強(qiáng)蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護(hù)時,，避免引入新的 RNase 污染就非常關(guān)鍵。由于 RNase 幾乎是**,，所以必須確保與純化的 RNA 接觸的每一樣?xùn)|西都是無 RNase 污染的,。所有的表面，包括移液器,、工作臺,、玻璃器皿和制膠設(shè)備，都必須用表面去污凈化溶液如 RNase 噴霧清除劑來處理過,，去除各種溶液或者反應(yīng)緩沖液中可能存在的 RNase 污染,，可以用 RNAsafe。必須保證一直使用無 RNase 的槍頭,、試管和溶液,，手套也應(yīng)經(jīng)常更換。 

3. 迅速滅活內(nèi)源的 RNA 酶,，以防止 RNA 降解 

以下 3 個方法均可有效使內(nèi)源 RNA 酶失活： 

1）用含離液（如胍鹽）的細(xì)胞裂解液收獲樣品,，并立即勻漿。 

2）用液氮瞬間凍結(jié)樣品,。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小,，在浸入液氮的瞬間

就能凍結(jié)，以確保瞬間令 RNA 酶失活,。 

3）立即將樣品置于 RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液中,。它是一種水相、無毒的收集試劑,，

能立即穩(wěn)定并保護(hù)完整,、未凍結(jié)的組織和細(xì)胞樣品中的 RNA,。關(guān)鍵要點(diǎn)是組織樣品切片一定要夠薄（<0.5 cm）,，這樣 RNAfixer 才能在 RNase 破壞 RNA 之前迅速滲入組織塊中,。                                               

4.選擇合適破壁方法 

細(xì)胞或組織的*勻漿對 RNA 提取來說，是一個很關(guān)鍵的步驟,，它能夠防止 RNA 的損失和降解,。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的類型來選擇。大部分培養(yǎng)的細(xì)胞可以置于細(xì)胞裂解液中,，通過簡單的渦旋震蕩來勻漿,；而動物組織、植物組織,、酵母和細(xì)菌,、真菌則常常需要更加劇烈的方法，通常用液氮研磨,。比如說細(xì)菌（特別是革蘭氏陽性菌）的細(xì)胞壁,，就需要溶菌酶消化來實(shí)現(xiàn)*的細(xì)胞裂解和 RNA 的最大回收，酵母提取時加入破壁酶幫助破壁,。 

5.選擇最適 RNA 提取試劑（盒） 

現(xiàn)有眾多的 RNA 分離方法也許令人難以取舍,。目前**也是**的方法是柱式分離,，也就是結(jié)合基于 Trizol 原理的裂解液和硅膠膜吸附柱的使用,，是目前比較通用的一種方法。

對于動物細(xì)胞,，組織,，植物葉片等常用材料都基本適用。植物 RNA 的提取比較難抉擇,，像根和果實(shí)等,，由于多糖，多酚物質(zhì)的存在,，很難純化,；還有就是血清等液體樣本的提取，水分多或者 RNA 含量少等,，較難提取,。可以采用針對性的試劑（盒） 

6. 低濃度 RNA 的沉淀 

純化得到的 RNA 可能需要通過沉淀來濃縮,，以滿足一些下游應(yīng)用的需要,。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀（加 0.1 體積的 5M  醋酸銨、2-2.5 體積的無水乙醇,，-20°C 放置 25 分鐘以上）可以很好地回收RNA,。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml）,，可以采用共沉淀（如  linear acrylamide 糖原 glycogen,酵母 yeast  RNA）的方法。核酸助沉劑是 linear  acrylamide,，當(dāng)RNA 用于 RT-PCR 分析時,，線性的丙烯酰胺和 DNase 處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因?yàn)樗鼈兌疾缓?DNA 污染,，糖原含量高會抑制 PCR 反應(yīng),，應(yīng)注意控制濃度，核酸助沉劑對 PCR 無影響,，成為病毒核酸提取的**,。酵母 RNA 和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染，有可能影響 RT-PCR 的結(jié)果,。沉淀后,，注意避免 RNA 沉淀過分干燥，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致很難重新溶解,。 

7.提取好的 RNA 如何儲存 

RNA 最好是提取完成后,，立刻進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。如果只是短期儲存,，重懸的 RNA 應(yīng)放置于-20°C,；如果是長期儲存的話，就應(yīng)該放置于-80°C,。儲存 RNA 時,，可以加入少量的 RNA酶抑制劑防止 RNA 的降解。 

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