手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
休止細胞制備少不了離心機
休止細胞制備少不了離心機,。
休止細胞反應又稱靜息細胞,把培養(yǎng)液中各種營養(yǎng)物質和生長因子洗去后懸浮在生理鹽水中培養(yǎng)一段時間，以消耗內源營養(yǎng)物質,，呈呈饑餓狀態(tài)的細胞,，在研究微生物的生理生化及新陳代謝中有廣泛的應用。它的主要特性就是細胞雖然處于休眠狀態(tài),，不進行生長繁殖,，但仍含有各種險系，其有氧化和發(fā)酵能力,，在適宜條件下可再恢復生長,。另外休止細胞反應專一性強,可以提高底物轉化率,不易染雜菌,可以減少產物對菌體生長及醇合成的抑制。
培養(yǎng)基的制備及滅菌：
按實驗材料中的培養(yǎng)基種類和數(shù)量配置相應培養(yǎng)基,，進行滅菌,。
菌種活化和擴大化培養(yǎng)
將E.coli cVcc249保藏菌種轉接到試管*固體培養(yǎng)基斜面,37℃下培養(yǎng)18~24h.
選取長勢良好的活化菌種轉接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16~18h,。
休止細胞的制備將三角瓶中的菌體倒入離心管中,，4000rpm離心機離心15min，收集沉淀,。
85%生理鹽水洗滌沉淀三次,，每次4000rpm離心機離心15min。
用pH 7.0的磷酸緩沖液（PBS)20mL（用量根據使菌體數(shù)量而定）制備菌懸液,，將制成的菌懸液放入4℃冰箱培養(yǎng)72hr,，以降低內呼吸，制得休止細胞,。
底物的配制：
分別配制濃度為0.1M的四種底物:乙酸鈉,、琥珀酸鈉、α -酮戊二酸鈉和檸檬酸鈉,。按照需要進行不同濃度梯度的稀釋,。
酶與底物反應：
在5mL的離心管中，加入0.4ml的休止細胞和0.4ml底物,，37℃恒溫30min;加入40ul噻唑鹽,，振蕩混勻，在37℃下反應.2hr;反應完后,，再離心管中加入1.5mL的二甲亞礬,，混勻振蕩，并在37℃恒溫箱中保溫 30min;加入蒸餾水1.5ml。
測定OD510值：
按照分光光度計的使用說明,，測定各個樣品的ODs1o值,，并做好實驗記錄。
整個實驗過程中一定要無菌操作,，尤其是活化菌株時,，因為所用的培養(yǎng)基為*培養(yǎng)基，一般的微生物也能生長,，為確保所測得的脫氫酶活性是來自于保藏菌種的,，所以第一步活化菌種時一定要確保無菌操作。
嚷唑鹽必須避光保存,，因其見光易分解,。另外，由于噻唑鹽和二甲基亞礬都有毒性,，再加入這兩種試劑時,，需戴手套進行操作。
休止細胞反應實驗操作在洗滌細胞時,，每次懸浮務必充分,，否則容易造成洗滌不干凈，導致有殘存的營養(yǎng)物質,，導致休止細胞的質量不好,。
在用分光光度計測量其OD值時，由于本實驗中所用的分光光度計適合的測量范圍在0.2~0.7中,，在測量前需檢測下樣品的OD值是否在這個范圍內,，如果過高，則加適量PBS稀釋,。另外,，在測量前，樣品需充分混勻,，且動作要快,，以免甲瓚又結晶出來，影響測量的結果,?？瞻讓φ諡檎麴s水。
免責聲明
- 凡本網注明“來源：化工儀器網”的所有作品,，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品,，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品,。已經本網授權使用作品的,，應在授權范圍內使用,，并注明“來源：化工儀器網”。違反上述聲明者,，本網將追究其相關法律責任,。
- 本網轉載并注明自其他來源（非化工儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息,，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責,，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體,、網站或個人從本網轉載時,，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任,。
- 如涉及作品內容,、版權等問題,，請在作品發(fā)表之日起一周內與本網聯(lián)系,，否則視為放棄相關權利。
采購中心